الفهرس Only 14 pages are availabe for public view
 |  | from | 201 |  |  |
| | | from | 201 | | |
Abstract
انزيم اليوريكيز او أكسيداز اليورات هو المسئول عن أكسده حامض اليوريك الى كل من الألنتوين و فوق أكسيد الهيدروجين. هذا الانزيم له فؤائد عديده حيث يلعب دورا هاما فى عمليات التمثيل الغذائى للنيتروجين الى جانب أهميته من الناحيه الطبيه حيث يستخدم كأداه تشخيصيه لقياس نسبه حامض اليوريك فى الدم والسوائل الخلويه.
فى هذه الدراسه تم عزل 30 عزلة من الاكتينوميسيتات من بيئات مختلفه (التربة والسماد ومخلفات الطيور) من محافظات الدقهلية- الاسكندرية- قنا بالاضافة الى بعض العزلات من المملكة العربية السعودية باستخدام بيئه خاصة بالاكتيتوميسيتات مضافا اليها (Nystatin) كمضاد للفطريات. تم اختبار قدرة جميع العزلات على انتاج انزيم اليوريكيز وبعد عدة سلاسل من الفحص الكيفى والكمى تم اختيار العزله (NEAE-F) كاقوى العزلات التى لها القدره على انتاج انزيم اليوريكيز. تم تعريف هذه العزله عن طريق دراسه الخواص المورفولوجية باستخدام الميكروسكوب الالكترونى وايضا عن طريق دراسة الصفات الفسيولوجية والبيوكيميائيه حيث تم تعريف هذة العزله على انها ستربوتوميسس ميوتابيليس (Streptomyces mutabilis ) تم تاكيد هذه النتيجة باستخدام الطرق الجينيه (16S rRNA) حيث تم إدراجها في قاعدة البيانات باسم ستربوتوميسس ميوتابيليس (Streptomyces mutabilis NEAE-F). تحت رقم القبول HQ916735.
تم دراسه بعض العوامل التى قد تؤثر على انتاجية الانزيم حيث وجد انه من بين عدة قواعد نيتروجينية مستخدمة ومواد اخرى مشابهة لها فى التركيب كان حامض اليوريك هو افضلها استحثاثا لانزيم اليوريكيز كما تم اختبار عدد ثلاثه من الاوساط الغذائيه المختلفه حيث وجد ان الوسط الغذائى (M 1) هو افضلهم حيث اعطى اعلى انتاجيه للانزيم. ايضا تم دراسه تاثير اضافه الجلوكوز (0.1 %) على انتاجيه انزيم اليوريكيز حيث وجد ان اضافة الجلوكوز يؤثر على انتاجية الانزيم وتقليلها الى النصف مقارنه بالوسط الغذائى الخالى من الجلوكوز على الرغم من الحصول على نفس الوزن الجاف تقريبا للكائن فى كلتا الحالتين. ايضا وجد ان افضل تركيز من حامض اليوريك لانتاج انزيم اليوريكيز هو 0.8 %.
تم تطبيق طريقة مفاضلة متتالية بغرض زياده انزيم اليوريكيز من ستربوتوميسس ميوتابيليس و التي بنيت على أساس تصميمات تجريبيّة و رياضيّة و إحصائيّة. اعتمدت الخطوه الاولى من هذه الطريقه على حصر عدد من العوامل الغذائيه التى قد تؤثرعلى نموالكائن ودراسة تاثير كل منها على انتاجيه انزيم اليوريكيز. فى هذا الجزء تم استخدام تصميم بلاكيت- بريمان ومن خلاله تم اكتشاف اهم العوامل التى تؤثر على انتاجيه الانزيم. حيث وجد ان كلا من كبريتات الامونيوم, كلوريد الصوديوم و كبريتات الماغنسيوم , هم اكثر العوامل الى ثؤثر ايجابيا على انتاجيه الانزيم. طبقا لنتائج بلاكيت-برمان وجد ان افضل وسط غذائى مقترح ويمكن التوصل اليه كالاتى: حامص اليوريك 0.4% , فوسفات ثنائي البوتاسيوم (K2HPO4 ) 0.2 %, مستخلص الخميره 0.1 % , نيترات البوتاسيم (KNO3) 0.2 % , كبريتات الامونيوم 0.2 % , كلوريد الصوديوم 0.05 % , كبريتات الماغنسيوم (MgSO4.7H2O) 0.05 % , كبريتات الحديدوز (FeSO4.7H2O) 0.01 % , حجم اللقاح (inoculum size) 2 مل , درجه الحموضه (pH) 7.5 , فتره التحضين 72 ساعه واخيرا درجه الحراره 40 oم وقد وجد ان نشاطية الانزيم المقدرة فى هذا الوسط الغذائى تصل الى 71.11) وحده/ ملم) والتى تمثل 6.3 ضعف نشاطية الانزيم التى تم الحصول عليها قبل تطبيق هذه الاستراتيجية.
الخطوه الثانيه فى هذه الاستيراتيجيه كانت عباره عن محاوله لتحسين العوامل الثلاثه والتى تتحكم فى انتاجيه الانزيم بجانب محاوله ايجاد افضل تركيزات لهم والتى تعطى اعلى انتاجيه محتمله الانزيم. في هذا الجزء, تم استخدام منهج الرّدّ الظّاهريّ (response surface methodology) و الأعتماد علي أساس تصميم بوكس- بيهنكين التجريبي للمتغيرات الثلاثة المستقلّة (NH4)2SO4, (X1); NaCl, (X2) and MgSO4.7H2O (X3) باستخدام ثلاث مستويات لكل واحد منهم -1, 0, 1. تم عمل نموذج متعدّد الحدود ((Polynomial-model يربط العلاقة بين المتغيّرات الثّلاثة المختبرة و نشاط إنزيم اليوريكايز وقد وجد أن نشاطية الأنزيم القصوى من هذا النّموذج المعدل تصل الى 92.47) وحدةً / ملم ) تحت الظّروف التّالية : 0.2 % كبريتات الامونيوم , 0.05 % من كلوريد الصوديوم واخيرا 0.09 % من كبريتات الماغنسيوم.
لتاكيد دقه النّموذج المتعدّد الحدود ((Polynomial-model تم اجراء تجربه تحت الظروف المتوقعه من التجربه السابقه حيث وجد ان نشاطيه الانزيم تصل الى (96.39 وحده/ ملم) حيث كانت النتيجه المتوقعه (92.47 وحده/ ملم).
تم دراسه بعض العوامل التى تؤثر على نشاطيه الانزيم الخام من ستربوتوميسس ميوتابيليس ((Streptomyces mutabilis NEAE-F حيث وجد ان افضل فترة تحضين مناسبة لانزيم اليوريكيز هيا 30 دقيقه. وقد وجد ان درجه الحموضة 8 ودرجة الحرارة 25 oم هما المثلتين و اللازمتين للحصول على اعلى انتاجية للانزيم. كما وجد ان الثبات الحرارى للانزيم عند درجة حرارة 40 oم حيث يحافظ على 59.1 % من نشاطيته بعد مرور 3 ساعات ويفقد 70.2 % من نشاطيته عند درجة حرارة 50 oم بعد 3 ساعات ايضا , بينما وجد ان الانزيم يحتفظ فقط ب 3.7 و 2.4 % من نشاطيته عند درجات حرارة 60 و70 oم على الترتيب بعد 3 ساعات. وقد وجد ان ثباتية الانزيم لتاثير تركيز الهيدروجين بين 8 الى 10 عالية حيث يحتفظ ب 75.7 % من نشاطيته بعد 24 ساعه عند هذه الدرجات.
تم تنقيه انزيم اليوريكيز المنتج خارج الخلايا من ستربوتوميسس ميوتابيليس (Streptomyces mutabilis NEAE-F) جزئيا عن طريق استخدام جهاز الفصل الكروماتوجرافي السائل السريع للبروتين حيث تم استخدام كبريتات الامونيوم 50 % ثم اتبع ذلك باستخدام استخدام عمود الكروماتوجرافي داي اثيل امينو اثيل- سيلولوز (DEAE-cellulose) حيث امكن الحصول ع انزيم منقى جزئيا عدد 1.8 مره وله نشاط نوعى 412.7 ملجم/ بروتين كما وجد ان الوزن الجزئى للانزيم حوالى 20 كيلو دالتون.
تم دراسه بعض العوامل التى تؤثر على نشاطية الانزيم المنقى جزئيا حيث وجد ان درجة التحضين المثلى هيا 30 دقيقه كما ان درجتى الحموضه والحراره المثلتين 8.5 ودرجة الحرارة 40 oم على الترتيب. كما تم دراسة الثبات الحرارى للانزيم المنقى جزئيا عند 40 oم حيث وجد انه يحافظ على 88.9 % من نشاطيته بعد ساعتين من التحضين عند نفس الدرجة, ولكن عند درجه حرارة 70 oم وجد ان الانزيم يحافظ على فقط 3.7 % من نشاطيتة عند تحضينة لمده ساعتين عند نفس الدرجة. اما ثبات الانزيم لتركيز ايون الهيدروجين فقد وجد انه يحتفظ باكثر من 80.9 % من نشاطيته لمده 12 ساعه عند 8 و 8.5 و 9 تركيز ايون الهيدروجين.
تم تطبيق بعض المحاولات لتحسين قدره الكائن على انتاج انزيم اليوريكيز بعائد أعلى عن طريق تقنية الاندماج البروتوبلازمى. حيث تم فى هذه التقنيه عمل طفره ل ستربوتوميسس ميوتابيليس ((Streptomyces mutabilis NEAE-F عن طريق تعريض جراثيمها للاشعة فوق البنفسجية لفترات زمنية مختلفة مما انتج عن ظهور خمسون سلالة مطفرة وقد وجد ان نسبة بقاء المطفرات تقل تدريجيا مع زياده فترات التعرض للاشعة فوق البنفسجية.
تم الحصول على مطفرات مقاومه لعدد 4 من المضادات الاحيائيه المختلفه (الكلوارمفينكول والتتراسكيلين والسيفالكسين والامبسيلين) ثم بعد ذلك تم اختبار قدرتهم على انتاج انزيم اليوريكيز عن طريق استخدام طريقة التقدير الكمي والتى يعبر عنها بمقدار المنطقه الرائقه التى تظهر حول كل عزلة. وجد انه من بين الخمسون سلالة المطفره هناك 23 سلاله تعطى منطقة رائقة اكبر حجما من تلك التى تعطيها السلالة الاصلية مما يدل على تحسن القدرة الانزيمية لهذه الطفرات وانتاجها لانزيم اليوريكيز بكميات اكبر من تلك اللى كانت تعطيها السلاله الاصلية بينما وجد ان السلالة رقم 47 قد فقدت القدره تماما على انتاج انزيم اليوريكيز حيث لم تظهر منطقه رائقة حول الكائن اما الباقون , فقد وجد ان المنطقه الرائقه والتى تعطى دلاله على كمية الانزيم المنتج اقل حجما من تلك التى تعطيها السلاله الاصليه. بعد ذلك تم اختيار سلالتين فقط هما السلالة رقم 16 والسلالة رقم 22 وذلك لقدرتهم العالية على انتاج انزيم اليوريكيز بدرجة 145% للسلالة رقم 16 و155 % للسلالة رقم 22 مقارنة بالسلالة الاصلية ايضا بسبب مقدرتهم المختلفه على الاستجابه للمضادات الاحيائيه المختلفه حيث وجد ان العزله رقم 16 مقاومه للكلورامفينكول والعزله رقم 22 مقاومه للتتراسكليين.
بعد اجراء عمليه الاندماج البروتوبلازمى البينى بين السلالتين 16 و 22 تم عزل 6 مندمجات لهم القدرة على النمو على وسط غذائى يحتوى على كل من للكلورامفينكول و التتراسكليين مما يثبت انهم مندمجات حقيقيه. تم اختبار قدرة هذه المندمجات على انتاج انزيم اليوريكيز حيث وجد ان اثنين منهم فقط لهم القدرة على انتاج الانزيم بنسبه تصل الى 182.5 % و 200 % اكبر من ستربوتوميسس ميوتابيليس (Streptomyces mutabilis NEAE-F) وهما المندمجه 3 والمندمجه 4 على الترتيب ، وايضا بنسبة 117.7 % و 129 % عند مقارنتهم باعلى الاباء انتاحا لانزيم اليوريكيز ايضا على الترتيب . تم مقارنة ودراسة صلة القرابة بين كل من من ستربوتوميسس ميوتابيليس ((Streptomyces mutabilis NEAE-F و السلالتين المطفرتين 22و 16 وايضا المندمجات 3 و 4 عن طريق تقنية التعددية الشكلية لقِطَع الـ DNA المُكاثرة عشوائيا (RAPD). حيث تم استخدام 5 بادئات مختلفه لكل من الخمس عزلات المستخدمه. وقد وجد انه بعد تحليل النتائج عن طريق بناء مصفوفة التماثل (Similarity matrix) واحداث مايسمى بالشكل العنقودى (dendrogram) ان درجة التشابه بين ستربوتوميسس ميوتابيليس Streptomyces mutabilis NEAE-F وبين كل من السلالتين المطفرتين 16 و 22 حيث بلغت 45 % و 64 % ع الترتيب ايضا وجد ان درجة التشابهة بين المدمجة 3 وكل من المطفرة الاولى (16) والمطفرة التانية (22) كانت 47 % و 71 % . اما درجة التشابهه بين المدمجة 4 وكل من المطفرة الاولى والمطفرة الثانيه بلغت 51 % و 71 %. من خلال ماسبق وعن طريق تقنية التعددية الشكلية لقِطَع الـ DNA المُكاثرة عشوائيا (RAPD) والتحليلات الاحصائيه يتضح ان هناك اختلاف على مستوى الجينوم بين ستربوتوميسس ميوتابيليس بعد استخدام الاشعه فوق البنفسجية وايضا بعد حدوث عملية الاندماج البروتوبلازمى البينى .