الفهرس 
general introduction
methodologyOnly 14 pages are availabe for public view
 |  | from | 378 |  |  |
| | | from | 378 | | |
Abstract
”انظمة حوامل نانوية للتهديف الدوائي للخلايا السرطانية“
الجسيمات النانوية هي جزيئات بأحجام غروية و تتراوح أقطارها بين 1 إلى 1000 نانومتر فيمكن كبسلة الأدوية أو امتزازها أو توزيعها بداخلها. لقد تم تطوير أنظمة ايتاء الأدوية النانوية للتحكم في توزيع الأدوية داخل الجسم (التوزيع البيولوجي) للحصول على فوائد علاجية أفضل والحد من الآثارالجانبية الضارة.
تساعد الجسيمات النانوية علي فتح آفاقا جديدة في علاج الأورام السرطانية من خلال وصولها بشكل انتقائي إلى الورم نظرا لصغر حجمها و قابليتها لتعديل خصائصها. و يعد استعمال الجسيمات النانوية في توصيل الادوية المضادة للسرطان وسيلة أكثر فعالية من العلاج بالادوية الكيميائية التقليدية التى لها العديد من السلبيات حيث ان معظم هذة الادوية تسبب سمية عالية للأنسجة الطبيعية ،كذلك تعانى من قصر العمر النصفي (t1/2) في الدم، وقلة الذوبان فى الماء، بالإضافة الى عدم الانتقائية و الكفاءة العلاجية المحدودة. و يتم مؤخرا إستغلال الجسيمات النانوية لتحضير نظم توصيل دوائية تسمح بإعطاء المرضى جرعات اقل من العلاج الكيميائي بشكل فعال بالإضافة الى التحكم في توزيع الدواء داخل الجسم.
في العقود القليلة الماضية ،اسفرت الأبحاث البيولوجية عن استراتيجيات شاملة مثل استخدام أنظمة توصيل دوائية متعددة الوظائف قادرة على التغلب على الحواجز الفيسيولوجية لتهديف خلايا محددة في الجسم .وقد استخدمت الجسيمات النانوية البوليمرية على نطاق واسع في هذا المجال لقدرتها العالية علي الثبات أثناء التخزين وسهولة تحضيرها. كما تستخدم على نطاق واسع ليس فقط لتحضير نظم توصيل للادوية الكيميائية بل ايضا للادوية الجينية المختلفة. وهناك بوليمرات متنوعة تستخدم في هذا المجال، منها البوليمرات الصناعية او الطبيعية ،مثل الشيتوزان و الجيلاتين. و يعد الجيلاتين واحد من البوليمرات الحيوية الطبيعية المستخدمة بكثرة في الصناعات الدوائية نظرا لسهولة توافره و لمأمونيته وانخفاض تكلفته و امكانية تعديل خصائص سطحه بالعديد من المجموعات الوظيفية النشطة من اجل تهديف الخلايا.
أنابيب الكربون النانوية (CNTs) واحدة من الجسيمات الغير عضوية الحديثة التى يمكن تحميلها بالدواء و هى تتكون من صفائح رقيقة من حلقات بنزينية مطوية في شكل اسطوانى تتسم بمساحة سطحية عالية تسمح بتحميل كميات كبيرة نسبيا من الدواء كما تتسم بقدرة على إختراق خلايا الأنسجة. و بواسطة إضافة ببتيدات(peptides) أو روابط معينة على سطحها ،يمكن أن تتعرف هذه الجسيمات علي مستقبلات سرطانية محددة على سطح الخلية. كما يمكن أن تحّمل أنابيب الكربون النانوية بمزيد من العقاقير بشكل آمن و فعال مع الوصول الي الخلايا التي كانت غير قابلة للوصول اليها من قبل.
الجوزاء ذو النشاط السطحي Gemini surfactant) ) هو فئة جديدة نسبيا من الجزيئات الامفيفيلية و التي تحتوي على رأسين و اثنين من السلاسل الدهنية، يربط بينهما فاصل صلب أو مرن. هذا التركيب الجزيئي يمنحها مزايا في الحد من التوتر السطحي، وزيادة في القدرة علي الإذابة، وانخفاض السمية الخلوية بتكلفة اقل لأنها تمتلك تركيزات اتحادية حرجة (CAC) اقل من اقرانها احادية الأجزاء بمقدار مرتين علي الاقل.
وهدفنا في هذة الاطروحة هو العمل على تشييد بوليمر جيلاتيني ذا قدرة تهديفية لخلايا العظم السرطانية وتكوين جسيمات بوليمرية بمساعدة أنابيب الكربون النانوية و الجوزاء ذو النشاط السطحي من أجل حوصلة الكوركمين(كعقار كيميائي) او أحد الاحماض النووية (كعقار بيولوجي جيني) لتهديف الخلايا السرطانية و الدخول إليها واستمرار إنطلاق الدواء فيها.
وبالتالي تنقسم أطروحتنا إلى ثلاثة فصول:
1- تشييد وتوصيف مشتقات الجيلاتين.
2- تحضير وتوصيف الجسيمات النانوية البوليمرية المهدفة للعظام، القائمة على الجيلاتين المعدل، والمحتوية علي الحمض النووي ((DNA.
2- تحضير وتوصيف الجسيمات النانوية البوليمرية المهدفة للعظام، القائمة على الجيلاتين المعدل، والمحتوية علي الكوركومين.
الفصل الأول :
تشييد وتوصيف مشتقات الجيلاتين.
تم تشييد مشتقات الندرونات الجيلاتين بنوعيه (أ) و(ب) باستخدام نسب جزئية مختلفة بين الجيلاتين:الالندرونات و هم 1:0.5و 1:1و 1:2و 1:4 و1:8. وتم تحديد خصائص البوليمرات المشييده وتعريفها بالوسائل العلميه المتعارف عليها و تعيين الثوابت الفيزيائيه و الكيميائيه لهذه البوليمرات.
ومن النتائج التي تم الحصول عليها ،تبيين الأتي:
درجة الإحلال (Degree of Substitution) في مشتقات الندرونات الجيلاتين قد زادت بزيادة كمية الالندرونات بينما كشف التحليل العنصري زيادة نسبة الفوسفور بزيادة كمية الالندرونات. و قد زادت درجة الإحلال في جيلاتين (أ) بنسب 9.6٪، 18.1٪، 24.1٪، 29٪ و 36٪ لكل من GA0.5، GA1، GA2، GA4 وGA8 على التوالي. في حين أظهر الجيلاتين (ب) درجة أعلى من الإحلال بنسب 16٪، 24.1٪، 34.8٪، 41.1٪ و 45.5٪ لكل من GB0.5، GB1، GB2، GB4 وGB8 على التوالي. كما تبيين ان الزيادة في كمية الالندرونات قد أدت إلى زيادة في درجة بلورة المنتج. وكان لمشتقات الجيلاتين (أ) نقط تساوي كهربائية (IEP)متفاوتة تراوحت بين 9.1 و 9.4 بينما كانت نقطة تساوي الكهربائية للجيلاتين (أ) الغير المعدل هي 9. و علي الجانب الاخر، كان لمشتقات الجيلاتين (ب) نقط تساوي كهربائية (IEP)متفاوتة بين 7 و 8، في حين أن نقطة تساوي الكهربائية للجيلاتين (ب) الغير المعدل هي 5 و بالتالي كان من الممكن تشييد مشتقات الندرونات الجيلاتين موجبة الشحنة في مجال واسع من الرقم الهيدروجيني pH)).
الفصل الثاني:
تحضير وتوصيف الجسيمات النانوية البوليمرية المهدفة للعظام، القائمة على الجيلاتين المعدل، والمحتوية علي الحمض النووي ((DNA.
تم إعداد الجسيمات النانوية البوليمرية المهدفة للعظام، القائمة على الجيلاتين المعدل و أنابيب الكربون النانوية و الجوزاء ذو النشاط السطحي Gemini surfactant) ) و الحمض النووي ((DNA.
و قد تم استخدام كل من مجهر زاوية برويستر (Brewster angle microscopy (BAM))، جهاز تعديل الاستقطاب للامتصاص الطيفي للاشعة تحت الحمراء PM-IRRAS)) ( Polarization modulation-infrared reflection adsorption spectroscopy)، مجهر القوة الذرية(Atomic force microscopy(AFM)) و مجهرمجس كلفن للقوة الذرية(Kelvin probe force microscopy(KPFM)) للتحقق من قدرة كل من الجوزاء ذو النشاط السطحي و الحمض النووي و أليندرونات الجيلاتين المعدل وأنابيب الكربون النانوية على التفاعل مع نموذج لكل من غشائ الخلايا السرطانية وغشاء الاندوسومات ( CHOL-DPPCو POPC-CHOL) للتدليل علي قدرتها في تعزيز نفاذية الغشاء والهروب الاندوسومي و من ثم توصيل الحمض النووي الي نواة الخلية.
لذا تم تصميم تحليل معاملى كامل(Full factorial analysis design) للوصول الي النسب المثلي لكل من الحمض النووي: الجوزاء ذو النشاط السطحي و الجوزاء ذو النشاط السطحي:الجيلاتين وايضا نوع الجيلاتين المستخدم في تصنيع التجمعات النانوية. و كانت النسب الجزئية(molar ratios) التي تم تقييمها بين الحمض النووي:السطحي الجوزاء هي 1:1، 1:5، 1:10 و 1:20. بينما النسب الوزنية بين الجوزاء ذو النشاط السطحي: الجيلاتين تتراوح بين 1:4، 1:2، 1:1، 2:1 و4:1 باستخدام كل من الجيلاتين (ا) و(ب) و مشتقاتهما (GA2، GA4، GA8، GB2، GB4 وGB8). استنادا إلى التحليل المعاملى، تم اختيار التجمعات النانوية ذات النسبة 1: 5 بين الحمض النووي : الجوزاء ذو النشاط السطحي ، و النسبة 1: 4 بين الجوزاء ذو النشاط السطحي : الجيلاتين و النسبة 5:1 بين الأنابيب النانوية الكربونية : الجوزاء ذو النشاط السطحي لاخضاعهم لمزيد من الاختبارات لتوصيف كفاءتهم علي توصيل الحمض النووي وذلك لصغر حجم هذه الجسيمات وأرتفاع جهد زيتا(zeta potential) لديهم.
استبعدت نتائج Langmuir isotherm قدرة الحمض النووي على أي اختراق فعال للنموذج الغشائي في حالة عدم وجود أنظمة توصيل (delivery vector)مع تغيير طفيف في المعامل الانضغاطي (CS-1) للغشاء. على العكس من ذلك، كان الجوزاء ذو النشاط السطحي 16-3-16 و الندرونات الجيلاتين قادرين على تمييع النموذج الغشائي. و اظهر الجيلاتين (أ) و مشتقاته تفاعلا مع النموذج الغشائي اكثر من الجيلاتين (ب) و مشتقاته. و كلما زادت درجة الإحلال، زادت معها قدرة الجيلاتين علي التفاعل. و قد اوضح جهاز تعديل الاستقطاب للامتصاص الطيفي للاشعة تحت الحمراء ان اضافة الندرونات الجيلاتين ادي الي تميع النموذج الغشائي ، حيث تحولت قياسات vas (CH2) and vs (CH2) إلى قيم أعلى وصلت الي 2924 و2851 سم1- علي التوالي مشيرة إلى قلة ترتيب السلاسل الدهنية مع تحول قياس في ν (C=O) من 1736 إلى 1743 سم1- دلالة علي تفاعل الندرونات الجيلاتين مع النموذج الغشائي. كما اظهرت صور AFM حبات الجيلاتين الكروية مبعثرة أو في شكل سلسلة مماثلة لتلك المجالات(domains) التي لوحظّت في صور BAM. وأكدت مقطعية صور KPFM أن GA4 له جهد موجب اعلي من الجيلاتين (أ) فكان الجهد السطحي لكل من GA4 و GAPهو 180+ و90+علي التوالي. وبالمثل، اظهرت نتائج Langmuir isotherm و تعديل الاستقطاب للامتصاص الطيفي للاشعة تحت الحمراء استطاعة الجوزاء ذو النشاط السطحي 16-3-16 ان يميع النموذج الغشائي نظرا الي عدم التطابق بين اطوال سلاسل الألكيل في الجوزاء ذو النشاط السطحي والسلسلة الجانبية للكولسترول و الي التفاعل الإستاتيكي مع النموذج الغشائي. وأخيرا، ادت الأنابيب النانوية الكربونية المنتشرة في الجوزاء ذو النشاط السطحي الي زيادة كبيرة (بمقدار 3 أضعاف) في الحد الأدنى من مساحة المقطع العرضي (∞A) وكان يرافقه زيادة كبيرة في المعامل الانضغاطي (CS-1) للغشاء من 255 الي 408 م ن/م. قدمت هذه النتائج دليلا على دمج الأنابيب النانوية الكربونية مع النموذج الغشائي ، مما يزيد من صلابة الغشاء، والقضاء على قدرة الجوزاء ذو النشاط السطحي علي تميع النموذج الغشائي.
وعند اختبار الجسيمات النانوية التي تحتوي علي الجوزاء ذو النشاط السطحي و الحمض النووي، كشفت صور مجهر القوة الذرية(AFM) مجمعات نانوية معينة الشكل(Rhomboidal) عند اضافة الجيلاتين و الجوزاء ذو النشاط السطحي الي الحمض النووي ،في غياب النموذج الغشائي. بينما ادت إضافة الأنابيب النانوية الكربونية إلى المركبات النانوية الي تقلييل التميع في النموذج الغشائي وتعزيز صلابته، مما يشير إلى أن إضافة الأنابيب النانوية الكربونية قد يكون في الواقع مضرا لعملية دخول الحمض النووي الي الخلية. من المرجح أن البنية الصلبة للأنابيب النانوية الكربونية ،التي امتزت بقوة على النموذج الغشائي، حدت من تنقل الجزيئات داخل النموذج الغشائي، مما أدى إلى الزيادة الملحوظة في صلابة النموذج الغشائي .وعموما ،كشفت دراستنا أن إضافة الجيلاتين اوالجيلاتين المعدل قد ساعدت علي تميع النموذج الغشائي، جنبا إلى جنب مع قدرته علي تهديف الخلية مما يجعلها تمثل ناقلات لا فيروسية واعدة.
و في دراسة لتقييم قدرة الجسيمات النانوية علي توصيل الحمض النووي للخلايا (Transfection study) ، كان الندرونات الجيلاتين قادر على تشكيل جسيمات نانوية مع بلازميد الحمض النووي (plasmid DNA) و السطحي الجوزاء 16-3-16 مع اظهار كفاءة عالية علي توصيل الحمض النووي للخلايا والبقاء علي حيوية الخلية عند المقارنة مع ® Lipofectamine 2000أو الجسيمات النانوية المكونة من الجوزاء ذو النشاط السطحي /الحمض النووي بدون الندرونات الجيلاتين. على وجه الخصوص، اظهرت الجسيمات النانوية التي تم تحضيرها باستخدام GA4 كفاءة عالية علي توصيل الحمض النووي للخلايا وهو ما يقرب من ثلاثة اضعاف كفاءة ® Lipofectamine 2000 و مرة و نصف كفاءة الجسيمات النانوية المكونة من إما الجوزاء ذو النشاط السطحي /الحمض النووي أو السطحي الجوزاء/ الحمض النووي /الأنابيب النانوية الكربونية.
الفصل الثالث:
تحضير وتوصيف الجسيمات النانوية البوليمرية المهدفة للعظام، القائمة على الجيلاتين المعدل، والمحتوية علي الكوركومين.
تم تحضير جسيمات نانونية حاملة لعقار الكوركمين باستخدام الندرونات الجيلاتين و الجوزاء ذو النشاط السطحي و أنابيب الكربون النانوية. و كانت الكميات المثلى لاستخدامها من الجيلاتين و الكوركمين هي 200 و 10 ملغ على التوالي. بينما كانت التركيزات المثلى لالجوزاء ذو النشاط السطحي 16-3-16 والأنابيب النانوية الكربونية هي 0.05٪ و 160 ميكروغرام من أنابيب الكربون النانوية/ 10 ملغ كوركمين على التوالي. وأظهر GA4 الدرجة المثلى من الالحلال اللازمة لتحقيق كفاءة حوصلية (Encapsulation Efficiency %) و قدرة تحميل دوائية اعلي (Drug Loading %).
وقد اثبتت الفحوصات التى استخدم فيها مشتت اشعة اكس ان العقار كان محوصلا داخل شبكة البوليمر وانه فقد الكثير من خواصه البللورية مما ادى الى زيادة الوقت المطلوب لانطلاق الدواء من الجسيمات النانونية. و قد وجد ان سرعة انطلاق الدواء كانت ابطىء فى البيئة ذات متوسط الرقم الهيدروجيني 7.4 مقارنة بالبيئة ذات متوسط الرقم الهيدروجيني 6.5. و قد اثبتت جميع انواع الجيلاتين المستخدمة- سواء المعدلة او غير المعدلة- عدم سميتها على خلايا MG-63 حتى فى اعلى التركيزات مما يؤكد على امان استخدامها كحوامل للدواء. بينما وجد ان سمية الكوركمين على نفس الخلايا تزداد عند حوصلته مع جسيمات الجيلاتين النانونية (المعدل او غير المعدل) مقارنة بالكوركمين بمفرده. و قد كشفت دراستنا أن جسيمات الجيلاتين النانونية الحاملة للكوركمين قد عززت التميع للنموذج الغشائي، مع زيادة قدرتها علي تهديف الخلية مقارنة بالكوركمين بمفرده.
لذلك فان الجسيمات النانونيه المعتمدة على الندرونات الجيلاتين و الجوزاء ذو النشاط السطحي يمكن اعتبارها انظمة واعدة لتهديف الأدوية لسرطان العظم نظرا لحجمها المناسب و احتوائها علي الالندرونات الذى يستهدف خلايا العظم.