الفهرس 
INTRODUCTIONOnly 14 pages are availabe for public view
 |  | from | 154 |  |  |
| | | from | 154 | | |
Abstract
تمت هذه الدراسة في قسم بيولوجيا الخلية، المركز القومي للبحوث، الجيزة، مصر، وفي قسم الوراثة، كلية الزراعة، جامعة عين شمس، القاهرة، مصر في الفترة من 2014 حتى 2017.
كان هدف هذا البحث دراسة تعدد الاشكال المظهرية على مستوى ال DNA في بعض الجينات المرتبطة بالخصوبة (LEP، DGAT1، BMP4، GHR و TNFα ) بين اناث الجاموس المصري باستخدام تقنيات PCR-RFLP وتحديد التتابعات للمناطق المستهدفة داخل الجينات ثم مقارنة التتابعات الناتجة بمثيلتها في بنك الجينات. و في النهاية تم استخدام بعض ادوات المعلوماتية الحيوية للتعرف على التأثيرات المحتملة لتعدد الاشكال للنيوكليوتيدات المفردة (SNPs) المكتشفة على بعض التتابعات المتحكمة في عملية ال splicing، و وظيفة وثبات البروتينات، والشكل الثانوي لل mRNA و معدل الاستطالة اثناء عملية الترجمة.
1- جمع عينات الدم و استخلاص ال DNA
تم جمع 81 عينة دم من اناث الجاموس المصري غير المرتبطة بقرابة. تم تجميع 30 عينة من مركز معلومات الماشية المصري و 51 عينة من محطة التجارب الزراعية بكلية الزراعة، جامعة القاهرة. تم استخلاص ال DNA من العينات بطريقةال salting out. تم تصميم ازواج من البادئات لكل جين.
2- تحديد الطرز الجينية للحيوانات:
أ. تم تضخيم قطعة من جين الLEP طولها 166 قاعدة مزدوجة بوسطة ال PCR ثم تم معاملتها بانزيم Eco91I و اتضح ان كل الحيوانات تحمل الطراز الجيني CC. وبتضخيم و تحديد تتابع قطعة طولها 511 قاعدة مزدوجة تم اكتشاف 4 SNPs بين عينات الجاموس المصري المختبر بالاضافة ال 21 SNPs بين تتابعات الجاموس المصري و مثيلاتها في بنك الجينات. و كان التشابه بين القطعة المضخمة من الجاموس المصري على مستوى ال DNA ومثيلاتها في الابقار و الاغنام و الماعز و البشر و الفئران يساوي 99 و 97 و 97 و 87 و79% اما على مستوى الاحماض الامينية فكان 100و 98و 98 و 85 و 82 %. و قد ادى الاستبدال T27C الى تعطيل intronic splicing silencer. بينما ادت الاستبدالات A114G، A310G، G263A و G379A الى تعطيل exonic splicing enhancers و في نفس الوقت ادى الاستبدالان الاخيران بتكوين exonic splicing enhancers جديدة. و قد ادت الاستبدالات A114G، C163A، A211G، G288A، A310G، A322G، G330C، C348T، T360C و G379A الى حدوث الطفرات S71G، T87N، N103S، E129K، E136G، Y140C، E143Q، R149W، S153P و R159Q على مستوى الاحماض الامينية. و قد تم تصنيف الطفرات N103S، E129K، E136G، Y140C، E143 و S153P على انها طفرات ضارة. و كانت الاحماض الامينية Y140، E143، N103 و R149 هي الاكثر لثباتا من بينالاحماض الامينية الطافرة. و كانت S71G هي الطفرة الوحيدة التي زادت ثبات بروتين ال LEP في حين ان باقي الطفرات قللت من ثباته.
ب. تم تضخيم قطعة من جين الDGAT1 طولها 511 قاعدة مزدوجة بوسطة ال PCR ثم تم معاملتها بانزيم EaeI و اتضح ان كل الحيوانات تحمل الطراز الجيني AA/AA. وبتحديد تتابع هذه القطعة تم اكتشاف 2 SNPs بين عينات الجاموس المصري المختبر بالاضافة ال 9 SNPs بين تتابعات الجاموس المصري و مثيلاتها في بنك الجينات. و كان التشابه بين القطعة المضخمة من الجاموس المصري على مستوى ال DNA ومثيلاتها في الابقار و الاغنام و الماعز و البشر و الفئران يساوي 97 و 98 و 97 و 77 و76% اما على مستوى الاحماض الامينية فكان 99و 100 و 100 و 77 و 81 %. الاستبدال G288A يعطل تتابع للDNA يمكن ان يعمل intronic splicing enhancer or silencer. و قد ادت الاستبدالات T14C و C372G الى حدوث الطفرات L203P وL266V على مستوى الاحماض الامينية و قد تم تصنيف الطفرة L203P على انها طفرة ضارة و لكن كل منهما كان يؤدي الى نقص ثبات انزيم الDGAT1. كان الحمض الاميني L266 شديد الثبات و كان L203 اقل ثباتا.
ج. تم تضخيم قطعة من جين الBMP4 طولها 414 قاعدة مزدوجة بوسطة ال PCR ثم تم معاملتها بانزيم HinfI و اتضح ان كل الحيوانات تحمل الطراز الجيني GG. وبتحديد تتابع هذه القطعة تم اكتشاف الاستبدال C172T بين عينات الجاموس المصري المختبر. و كان التشابه بين القطعة المضخمة من الجاموس المصري على مستوى ال DNA ومثيلاتها في الابقار و الاغنام و الماعز و البشر و الفئران يساوي 99 و 99 و 99 و 95 و92% اما على مستوى الاحماض الامينية فكان 99و 100 و 100 و 99 و 98 %. و قد ادى الاستبدال C172T الى حدوث الطفرة H177Y على مستوى الاحماض الامينية و قد تم تصنيف هذه الطفرة على انها طفرة غير ضارة في برغم ان الحمض الاميني H177 شديد الثبات.
د. تم تضخيم قطعة من جين الGHR طولها 154 قاعدة مزدوجة بوسطة ال PCR ثم تم معاملتها بانزيم SspI و اتضح ان كل الحيوانات تحمل الطراز الجيني TT. وبتضخيم و تحديد تتابع قطعة طولها 265 قاعدة مزدوجة تم اكتشاف اختلافات عبارة عن حذف 3 قواعد مزدوجة و 5 SNPs بين تتابعات الجاموس المصري و مثيلاتها في بنك الجينات. و كان التشابه بين القطعة المضخمة من الجاموس المصري على مستوى ال DNA ومثيلاتها في الابقار و الاغنام و الماعز و البشر و الفئران يساوي 97 و 94 و 94 و 77 و83% اما على مستوى الاحماض الامينية فكان 100و 97و 93 و 74 و 82 %. و قد ادى الاستبدال G60T الى تعطيل exonic splicing enhancers.
ه. تم تضخيم قطعة من جين ال TNFα طولها 592 قاعدة مزدوجة بوسطة ال PCR ثم تم معاملتها بانزيم RsaI و اتضح ان كل الحيوانات تحمل الطراز الجيني CC. وبتحديد تتابع هذه القطعة تم اكتشاف 3 SNPs بين عينات الجاموس المصري المختبر و تتابعات الجاموس في بنك الجينات. و كان التشابه بين القطعة المضخمة من الجاموس المصري على مستوى ال DNA ومثيلاتها في الابقار و الاغنام و الماعز و البشر و الفئران يساوي 98 و 96 و 95 و 81 و76% اما على مستوى الاحماض الامينية فكان 100و 92 و 92 و 85 و 76 %. الاستبدالان A110G و G383A يعطلان تتابعان للDNA يمكن ان يعملان exonic splicing enhancers.
3- جدول استخدام الكودونات للجاموس النهري
تم حساب جدول استخدام الكودونات اعتمادا على 20209 تتابعات DNA مشفرة تحتوي على 10836122 كودون. و كانت نسبة قواعد الG و C 53,74% . كان كودون الليسين CTG اكثر الكودونات تكرارا و كان كودون الارجنين CGT اقلها تكرارا. اما كودوني الليسين CTG و فكانCTA لهما اعلى (2,49) و اقل ( 0,372) قيمة لل RSCU، في حين ان كودون TGA هو اكثر كودونات التوقف استخداما.
4- تأثير الاستبدالات المكتشفة على الشكل الثانوي لل mRNA و تأثير ال synonymous SNPs
أ. كان التركيب الثانوي لل mRNA للطراز البري لجين الLEP له MFE= -1101,5 كيلو كالوري\مول. و قد ادى الاستبدال G206A الى تكوين شكل لل mRNA له اقل قيمة تشابه مع الطراز البري (85,27%). كان الاستبدالان G206A و A114G اكثر و اقل الاستبدالات تثبيتا للشكل الثانوي بالترتيب. الاستبدالان A310G و G206A كان لهما اعلى و اقل قيمة لل PP% بالترتيب. كانت قيمة dRSCU% للاستبدالات G140A، T197C، G206A، C242T، G263A، G278A، T284C، C302T، C314T، G386A و T398C تساوي -41,64 و 27,68 و -85 و -41,6 و 79,13 و -85 و 74,82 و -32,5 و -41,6 و -85 و 30,07 بالترتيب.
ب. كان التركيب الثانوي لل mRNA للطراز البري لجين الDGAT1 له MFE= -1757,3 كيلو كالوري\مول. و قد ادى الاستبدال G356C الى تكوين شكل لل mRNA له اقل قيمة تشابه مع الطراز البري (98,49%). كان الفرق بين MFE للطراز البري و الاستبدالات T14C، C42T، G356C و C372G يساوي -1,7 و -2,6 و -0,3 بالترتيب. الاستبدالان T14C و C372G كان لهما اعلى و اقل قيمة لل PP% بالترتيب. كانت قيمة dRSCU% للاستبدالات C42T و G356C تساوي -22,7 و 148,92% بالترتيب.
ج. كان التركيب الثانوي لل mRNA للطراز البري لجين ال BMP4له MFE= -526,9 كيلو كالوري\مول و قيمة PP%= 53,62%. الاستبدال C172T كان له نفس التركيب الثانوي للطراز البري و لكن كان MFE و PP% تساوي -524 كيلو كالوري\مول و 47,72% بالترتيب.
د. كان التركيب الثانوي لل mRNA للطراز البري و الاستبدال T154A لجين ال GHR له MFE= -921,84 كيلو كالوري\مول و قيمة PP%= 71,96% . و كانت قيمة dRSCU% للاستبدال T154A تساوي 127,68%.
ه. كان التركيب الثانوي لل mRNA للطراز البري لجين ال TNFα له MFE= -629,7 كيلو كالوري\مول. الاستبدال A110G لم يغير التركيب الثانوي و لا
قيمة MFE للطراز البري. و قد ادى الاستبدالان G383A و C510T الى تركيبان تشابهما مع الطراز البري يساوي 46.34 و 45,24% و ال MFE لهما يساوي -627,7 و -629,6 كيلو كالوري\مول بالترتيب. الاستبدال C510T كان له اعلى قيمة PP% و التي تساوي 68,69%. و كانت قيمة dRSCU% للاستبدالات A110G و G383A تساوي -53,23 و -9,61% بالترتيب.
هذة الدراسة توضح وجود بعض التغيرات في جينات الخصوبة في الجاموس المصري و التي قد تؤثر على خصوبة او عقم الجاموس. و كان جين LEP يحتوي على اكبر عدد من التغيرات على مستوى ال DNA.