الفهرس 
ContentsOnly 14 pages are availabe for public view
 |  | from | 187 |  |  |
| | | from | 187 | | |
Abstract
مرض جدرى الأغنام هو مرض جلدي معدي خطير يعتبر من أهم الأمراض الفيروسية اقتصاديًا التي تصيب الأغنام والماعز. جدرى الأغنام مستوطن في مصر والعزل المستمر والتوصيف للفيروس الحالي المنتشر في مصر مطلوب لتوفير طرق أكثر موثوقية للكشف عن تفشي الفيروس والسيطرة عليه، لذلك تم التخطيط لهذه الدراسة لعزل جدري الأغنام من خمس محافظات مصرية، مع الكشف الجزيئي عن بعض جينات الفيروس. بعد ذلك تأتي محاولاتنا للتكيف و تكاثر بعض هذه العزلات في خط خلايا فيرو .
حيث أظهرت التجارب العملية ما يلى:
محاولات لعزل فيروس جدري الأغنام من عينات الجلد (العقيدات والقشور) من الأغنام التي يشتبه انها تعاني من مرض جدري الغنم عن طريق التمريرأربع مرات علي غشاء الكوريونى لأجنة البيض المخصب الخالى من األمسببات المرضية و تسبب الفيروس المعزول في ظهور الأثر الباثولوجى المميز والذى ظهر في شكل إصابات تنكرزية صفراء رمادية منفصلة مميزة للعينات التي تم فحصها.
أظهر الكشف عن عزلات جدرى الأغنام باستخدام تقنيات تفاعل البلمره المتسلسل التفاضلي لفيروسات Capripoxvirus أن الفيروسات المعزوله كانت متباينة عن فيروس الجلد العقدى وفيروس جدرى الماعز.
تم معايرة خمس عزلات مصرية من SPV (محافظات الجيزة، المنوفية، كفرالشيخ، مطروح، الوادي الجديد) على SPF-ECE، وكان عيار عزلات الوادي الجديد و مطروح هي(5.5 log10 EID50/ml )في التمريره الرابعه بينما كانت عيارات عزلات الجيزه، كفر الشيخ،المنوفيه هي(5 log10 EID50/ml ) في التمريره الرابعه.
تم إكثار عزلات SPV محافظات (الجيزة ، المنوفية ، كفر الشيخ ، مطروح ، الوادي الجديد) ومعايرتها في مزارع الخلايا LT الأولية لخمسة تمريرات ، مع ظهور CPE في الطبقة الأحادية للخلايا بعد 4 أيام من الحقن في التمريره 3 إلى 5 ، والتي تتميز بـ تشكيل آفات بؤرية منفصلة على مناطق في طبقة الخلية تتكون من مجموعات من الخلايا المنكمشة والمستديرة والحبيبية. بلغ عيار عزلات الوادي الجديد ومطروح(6.2 log10 TCID50/ml) في التمريره الخامسه وكان أعلى عيار لعزلة الجيزه( 5.7 log10 TCID50/ml)، وعزلات كفر الشيخ ، المنوفيه كانت (5.2 log10 TCID50/ml) في التمريره الخامسة.
الفحص الهستوباثولوجي لخلايا LT المحقونه و بأستخدام صبغة H&E بعد 48 ساعة و 72 ساعة ظهرت تحتوي على من واحد إلى عدة أجسام متضمنة داخل السيتوبلازمICIB) )ذات أحجام متغيرة ، غالبًا على شكل قوس مكسور باتجاه أطراف الخلايا.
تم اختيار SPV لعزلات (الوادي الجديد ، مطروح ، الجيزة) ذات أعلى معايرة لانتقالها على خط خلايا فيرو. تسبب الفيروس المنتشر في إحداث الأثار الباثولوجية المميزة للفيروس (CPE) الخاصة بـ SPV والتي ظهرت في شكل تدوير الخلايا ، وتجمعها ثم في النهاية التفريغ. زاد CPE تدريجيًا حتى يشمل 70-90٪ من الخلايا تمامًا.
أظهرت معايرة العدوى لتمريرات مختلفة من فيروس جدري الأغنام على خلايا فيرو أن أعلى عيار قد تم الوصول إليه مما يشير إلى درجة معينة من التكيف مع الفيروس، مصحوبة بارتفاع مطرد في عيار الفيروس (10 6.5 TCID 50/ml).
دراسة خاصة لسلوك النمو لهذه العزلات المختارة للكشف عن أنسب جرعه للفيروس المتكيف مع جدري الغنم للحقن على خلايا فيرو ، لمعرفة أفضل وقت لحصاد الفيروس. أظهرت نتائجنا أن 0.01 MOI هو الحل الأمثل.
كما تم عمل منحنى النمو الكلاسيكي للفيروسات الخالية من الخلايا (CFV) والفيروسات المرتبطة بالخلايا (CAV). لاحظنا أن نتائج حركية النمو تأتي مماثلة لتلك التي تم الحصول عليها من خلال منحنى النمو حيث أن أفضل وقت للحصاد كان 4-5 أيام بعد الحقن مع عيار مرتفع من الفيروس داخل الخلايا الملقحة.
للتعرف المصلي والصفات الأنتيجينيه لعزلة SPV مختارة ، تم عمل FAT غير المباشر على خلايا Vero المصابة. تظهر خلايا Vero المصابةالمصبوغه بماده فلوروسينيه وهي ( FITC) بعد 72 hpi. محتويه علي وجود انبعاث وميض أخضر حول النواة وداخل السيتوبلازم.
تم عمل أختبار الأليزا الغير المباشر المرتبط بالخلايا (ICBE) للتعرف على بروتين SPV في طبقة الخلايا المصابة باستخدام مصل متغاير مضاد لفيروس جدرى الغنم محضر داخل الأرنب. لوحظ أن لونًا بنيًا محمرًا يظهر عند 72 و 96 ساعة PI باستخدام انزيم(Horse Reddish Peroxidase (HRP)
عدوى تجريبية للأغنام بأستخدام عزلة SPV المنتقاه، مما أدى إلى ارتفاع طفيف في درجة الحراره وتورم والتهاب محدود في موقع التلقيح لمدة يومين بعد التلقيح. كما كانت الغدد الليمفاوية السطحية متضخمة بشكل خفيف دون ظهور آفات جدري معممة في جميع جسم الحيوانات. تم اعتبار التفاعل الموضعي لفرط الحساسية (الورم والسخونة والاحمرار) هو الحكم على مدي الخصائص الأنتيجينيه والمرضيه للفيروس.
يتم إجراء الـ SNT على مستويين ، الأول هو مصل الحيوانات المصابة طبيعياً التي تم جمعها من 5 محافظات مصرية مع أقصى شدة NI كانت 1.5 والتي تظهر في الأسبوع الثاني بعد الإصابة. يتم جمع المصل الثاني من مجموعة من الأغنام المصابة تجريبياً التي تلقت عزلة الوادي الجديد المكيفة الموهنة SPV و في هذه المجموعة من الحيوانات، وصل NI إلى 2.5 في الأسبوع الثالث بعد التلقيح واستمر في الأسبوع الرابع بعد التلقيح.
تم تقييم قدرة فيروس جدري الأغنام المعزول المختار علي الحث على الاستجابة المناعية الخلوية من خلال إنتاج جاما الإنترفيرون (IFN γ) بأستخدام أنزيم تفاعل البلمره المتسلسل للنسخ العكسي (RT-qPCR) من أجل القياس الكمي للجين المحدد INF-mRNA في كرات الدم البضاء من نوع (PBMCs). نتائج تقدير مستويات INFγ mRNA بواسطة RT-qPCR كانت 3.5439 ± 0.169 ، 4.4691 ± 0.153 ، 2.5847 ± 0.080 و 1.2638 ± 0.105 أضعاف التعبير عند 7 و 14 و 21 و 28 يوم بعد الحقن.
جميع عزلات SPV بالإضافة إلى العترتين المرجعيتين الرومانيه والكينيه أدت إلى إشارة PCR إيجابية عند طول 390 bp و 483 bp و 570 bp لجينات P32 و ORF095 و ORF103.
بأستخدام تحليل التسلسل النيوكلوتيدي الجزئي، ارتبطت السلالات التطعيمية الكينية والرومانية مع عزلات الجيزه ومطروح على التوالي، بينما تم تجميع ثلاث سلالات مصرية أخرى من SPV مع بعضها البعض باستخدام الجين P32 بينما ارتبطت سلالات SPV-الوادي الجديد وكفر الشيخ و المنوفية بمجموعة سلالات SPV الآسيوية (الأحساء ، أبو غريب والمملكة العربية السعودية)و تركيا.
بأستخدام تحليل التسلسل النيوكلوتيدي الجزئي، ارتبطت السلالات التطعيمية الكينية والرومانية مع عزلات الجيزه ومطروح على التوالي، بينما تم تجميع ثلاث سلالات مصرية أخرى من SPV مع بعضها البعض باستخدام الجين ORF095 بينما ارتبطت سلالات SPV-الوادي الجديد وكفر الشيخ و المنوفية بمجموعة سلالات SPV من أصل آسيوي وتركي.
تحليل التسلسل الجزئي لعزلات SPV على أساس الجين ORF103. ارتبطت SPV-عزلات الوادي الجديد و SPV-كفر الشيخ و SPV-المنوفيه ببعضها البعض ؛ أيضا SPV-الجيزه وكانت ذات الصلة سلالة كينية. تم إرجاع SPV-عزلة مطروح إلى سلالة SPV الآسيوية (Abugharib) والسلالة الأفريقية بينما كان ORF103 للسلالات التطعيمية الرومانية مرتبطًا نسبيًا بسلالة الجلد العقدي.