الفهرس 
Scope of workOnly 14 pages are availabe for public view
 |  | from | 387 |  |  |
| | | from | 387 | | |
Abstract
إن الورم الأرومي الدبقي المتعدد الأشكال هو أحد أكثر الأورام الخبيثة إنتشاراً و يمثل 60% من أورام المخ الخبيثة للبالغين. و لا يزال علاج هذا الورم يمثل تحدياً كبيراً فى علم الأورام بالرغم من المجهودات العالمية المبذوله فى هذا المجال. إن التحديات التى تواجه علاج هذا الورم مرتبطة إرتباطاً وثيقا بموقع الورم وتعقيد خلاياه و عدم تجانسها. إن البروتوكول القياسى المتبع فى علاج هذا الورم يعتمد على التدخل الجراحي لإزالة الورم متبوعاً بالعلاج الإشعاعى مع العلاج الكيميائي بإستخدام التيموزولميد. وقد أظهر هذا البروتوكول تحسناً تدريجياً فى معدل البقاء على قيد الحياة مع تحسين مستوى الحياة و ان كانت درجة السيطرة على تطور المرض مازالت غير مطمئنة.
يعتبر عقار التيموزولميد هو خط الدفاع الأول ضد مرض الورم الأرومي الدبقي المتعدد الاشكال. إن التيموزولميد هوعقار مؤلكل للحمض النووي من فئة الإيميدازوتيترازين و هو متوفر للعلاج الفموي. عقب تناول عقار التيموزولميد يتم إستقلاب نسبة ضئيلة منه الى حمض التيموزولميد ,المشتق الحمضي للعقار. إن حمض التيموزولميد هو أيضًا عقار سام للخلايا و قد ثبت ان تركيزه المثبط ل50% من الخلايا مساوي للتركيزالخاص بالتيموزولميد. فى درجة الحموضة الفسيولوجية, يتم تحلل عقار التيموزولميد الى كاتيون الميثيل ديازونيوم النشط المسئول عن ألكلة الحمض النووي. إن عقار التيموزولميد يعاني من بعض العوائق حيث انه غير مستقر فى درجة الحموضة الفسيولوجية و يصل نصف عمره فى البلازما الى 1.8 ساعة فقط عند الرقم الهييدروجينى 7.4. كما أن المناعة المتأصلة والمكتسبة ضد عقار التيموزولميد التى تنتج بسبب وجود البروتينات المقاومة للأدوية المتعددة و بروتين التدفقP-gp قد تؤدى الى فشل العلاج. كما أن المسار الغير موضعى للعقار قد يؤدى الى ظهور بعض الأثار الجانبية مثل الغثيان والتعب والصداع وإنضغاط النخاع.
إن العلاج الفعال لأمراض المخ يتطلب التوصيل الجيد للدواء للمخ , و لكن الكثير من المواد الفعاله لا تستطيع الوصول الى المخ بسبب الحواجز التى تحميه مثل حاجز الدم فى الدماغ حيث انه يتكون من الخلايا البطانية, خلايا نجمية و خلايا حوطية . إن الخلايا البطانية المكونه لهذا الحاجز ملتصقه ببعضها بوصلات شديدة الالتصاق مع غيابأاى فتحات ,كما أنها تحتوى على ناقلات تمنع دخول و تساعد على خروج المركبات الموجوده داخل الجسم و المركبات الخارجية . و قد تم إستخدام الكثير من التقنيات لتحسين مرور الدواء عبر حاجز الدم فى الدماغ. و تعتبر الحوامل النانونية من أكثر التقنيات الواعده فى هذا المجال حيث أنها تستطيع عبور حاجز الدم فى الدماغ بأساليب مختلفة. كما أن الحوامل النانونية تتميز بقدرتها على حماية العقارات المحملة بداخلها و توصيلها الى الموقع المستهدف مع تقليل الأثار الجانبية.
إن الزلال البشري هو من أكثر البروتينات إنتشارًا فى البلازما كما أن خصائصه الغير مناعية و توافقه الحيوي و وجود مواقع متعددة لربط الادوية فى تركيبته تجعله مرشح مثالي للتوصيل الدوائي عن طريق الحوامل النانونية. كما أن التواجد المفرط لمستقبلات الزلال البشري مثل SPARC و gp 60 على سطح خلايا المخ السرطانية تسهل وصوله الى خلايا الورم بالاضافة الى امتصاصه التفضيلي عن طريق خاصية تعزيز النفاذية والاحتفاظ الخاصة بالاورام السرطانية.
إن الهدف من هذه الرسالة هو تحميل عقار التيموزولميد / حمض التيموزولميد على حوامل الزلال البشري النانونية لحمايته من التحلل المبكر فى درجة الحموضة الفسيولوجية و التأكد من وصوله الى خلايا المخ السرطانية مع تقليل أثاره الجانبية. و عنه, ينقسم العمل فى هذه الرسالة الى ثلاثة أجزاء:
الجزء الأول: الفصل الأول: تعظيم و تحميل عقار التيموزولميد على حوامل الزلال البشري النانونية
إن الهدف من هذا الفصل هو تعظيم العوامل التصنيعية المختلفة لتحميل عقار التيموزولميد على حوامل الزلال البشري النانونية. أولًا, تم دراسة تأثير نوع المذيب العضوي (الإيثانول و الأسيتون) و زمن التشابك (2, 6 , 24 ساعة) على حجم الجسيمات الفارغة المكونه, مؤشر التشتت المتعدد و جهد الزيتا الخاص بالجسيمات المكونه. وقد وجد أن حجم الجسيمات المحضره باستخدام الإيثانول أكبر من مثيلاتها المحضره بالأسيتون. وقد وجد أن جميع الجسيمات المحضره هى أحادية الإنتشار و ذات جهد زيتا سلبي. كما أن إختلاف زمن التشابك لم يكن له اى أثر إحصائي بارز على جميع الخواص المدروسه و لذلك تم اختيار 24 ساعة كزمن تشابك للإستخدام فى الدراسات القادمة.
تم تحميل عقار التيموزولميد على حوامل الزلال البشري النانونية المكونه وتم دراسة تأثير نوع المذيب العضوى (الإيثانول و الأسيتون) و تركيز الزلال البشري و ووجود العوامل ذات النشاط السطحي و كمية العقار المستخدمة على حجم الجسيمات المكونه, مؤشر التشتت المتعدد, جهد الزيتا الخاص بالجسيمات المكونه و نسبة تحميل الدواء. وقد وجد أن حجم الجسيمات المحضره بإستخدام الإيثانول أكبر من مثيلاتها المحضره بالأسيتون. ولكن أظهر التيموزولميد عدم إستقرار فيزيائي وكيميائي في الجسيمات المكونه باستخدام الإيثانول مع انخفاض ملحوظ في نسبة تحميل الدواء مقارنة بالجسيمات المحضره بإستخدام الأسيتون. و مع زيادة تركيز الزلال البشري، زاد حجم الجسيمات بشكل ملحوظ ولكن لم يكن هناك تأثير بارز على نسبة تحميل الدواء. و قد وجد أن التركيبة المحتوية على Tween® 80 لها حجم جسيمي و نسبة تحميل دواء أكبر من مثيلتها التى إستخدم كولات الصوديوم فى تحضيرها. كما أدت زيادة كمية التيموزولميد إلى زيادة حجم الجسيمات و زيادة نسبة تحميل الدواء . و قد أسفرت جميع العوامل المختبرة عن جزيئات أحادية الإنتشار و سالبة الشحنة. أخيرًا ، قد اعطت التركيبة F7 المكونة من 10 مجم / مل من الزلال البشري و 4 مجم التيموزولميد المذاب في الماء ومحضره باستخدام الأسيتون أعلى نسبة تحميل دواء (0.16 ٪) بحجم جسيمى معقول (145 نانومتر) و قد تم إختيارها لإختبار سميتها الخلوية على خلايا GL261 و BL6.. ان نسبة تحميل دواء التي تم الوصول اليها ليست كافية ,وفقًا لذلك ، سيتم استخدام حمض التيموزولميد بدلاً من التيموزولميد للتحميل في جسيمات الزلال البشري.
الفصل الثاني: تحضير و توصيف حوامل الزلال البشري النانونية المحملة بحمض التيموزولميد
في هذا الفصل ، تم إجراء تعظيم أولي لعوامل التحضير المختلفة ، متبوعًا بتصميم تجربة لتطبيق الطرق الاحصائية المتقدمة التي تعمل عن طريق الحاسوب لتحديد ظروف الصياغة المثلى لأفضل تحميل للعقار وحجم الجسيمات. و قد اشتمل التحسين الأولي على تقييم ؛ نوع المذيب العضوي ، ونسبة كمية المذيب العضوي للمذيب المائي وتأثير وقت التشابك على حجم الجسيمات ، مؤشر التشتت المتعدد و جهد الزيتا الخاص بالجسيمات المكونه و كذلك نسبة تحميل الدواء داخل الجسيمات. و قد أظهرت الحوامل النانونية المحضره باستخدام كلًا من الإيثانول والأسيتون اختلافًا ضئيلًا في حجم الجسيمات و جهد الزيتا. ولكن ، أظهرت التحضيرات القائمة على الإيثانول نسبة تحميل أعلى للدواء مع عدم وجود اى علامات لعدم الاستقرار. و مع زيادة نسبة كمية المذيب العضوي للمذيب المائي ، انخفض مؤشر التشتت المتعدد بشكل ملحوظ من 0.42 إلى 0.16 مع عدم وجود تأثير مختلف بشكل كبير على بقية الإستجابات المختبرة. و مع زيادة زمن التشابك من 2-18 ساعة ، لم يكن هناك تأثير احصائي بارز على حجم الجسيمات. ولكن، زادت نسبة تحميل الدواء داخل الجسيمات بشكل ملحوظ وتم تحويل جهد الزيتا من المقياس السلبي إلى الجانب الإيجابي عند 18 ساعة من التشابك. وفقًا لذلك ، تم إختيار الإيثانول بنسبة 4: 1 إلى المذيب المائي مع التشابك لمدة 18 ساعة للاستخدام فى التجارب التالية.
وعنه, فقد تم تطبيق الطرق الإحصائية المتقدمة التي تعمل عن طريق الحاسوب لتعظيم صفات الجسيمات المحملة بحمض التيموزولميد. وفي هذا المضمار تم تقييم تأثير كمية حمض التيموزولميد وكذلك تركيز كولات الصوديوم على حجم الجسيمات و نسبة تحميل الدواء داخل الجسيمات مع تثبيت تركيز الزلال البشري عند 10 مجم / مل. وقد اثبتت هذه الدراسة أن كمية حمض التيموزولميد لها تأثير سلبي على حجم الجسيمات ، بينما كان لتركيز كولات الصوديوم تأثير إيجابي على حجم الجسيمات. اما بالنسبة لنسبة تحميل الدواء فقد وجد أن كمية حمض التيموزولميد فقط هى التي تؤثر إيجابيًا على نسبة تحميل الدواء. و بناءًا على النتائج الاحصائية التي تم الحصول عليها عن طريق الحاسوب ، تم إختيار التركيبة (A6) التى تحتوى على 4 مجم حمض التيموزولميد مع 0.05٪ كولات الصوديوم و لها حجم جسيم يبلغ 109.3 نانومتر مع نسبة تحميل الدواء 5.52% للدراسات التاليه. و قد وجد ان جميع الجسيمات المختبرة لها جهد زيتا موجب بسبب إنخفاض درجة الحموضة في المستحضر.
تم إجراء الفحص المورفولوجي لـلجسيمات المختارة بالإضافة إلى نظيرتها الفارغة بواسطة المجهر الإلكتروني. أظهر كلاهما جسيمات كروية لكن الجسيمات الفارغة كانت أكبر بشكل ملحوظ مع سطح أملس. وقد أظهرت الحوامل النانونية المحملة بالعقار بعض التعرجات السطحية بينما تطابق حجمها مع الحجم الذى تم الحصول عليه باستخدام تقنية تشتت الضوء الديناميكي(DLS) . من خلال دراسة نمط الإنطلاق ، أظهر حمض التيموزولميد إنطلاقًا سريعًا من الجسيمات متبوعًا بإنطلاق مستمر حتى 24 ساعة. ولكن ، بإضافة المصل البقري الجنيني (FBS) ، تزايدت سرعة انطلاق العقار مما يعكس مشكلة محتملة في التحضيرة. و قد اظهرت تحضيرة A6 المختارة استقرارا عند التخزين عند 4 درجات مئوية حتى 3 أشهر بالإضافة إلى إستقرارها عند الحضانة مع10٪ و 50٪ من المصل البقري الجنيني حتى 24 ساعة.
تم تحميل حمض التيموزولميد في حوامل الزلال البشري النانونية بنجاح مع الحصول على حجم جسيمات مناسب للتوصيل للمخ. و قد أظهرت الجسيمات المحضرة خصائص ثبات جيدة وسيتم إستخدام تحضيرة A6 لمزيد من الدراسات في المختبر وفي الجسم الحي. ولكن ، فإن الإنطلاق السريع نسبيًا للدواء من الحوامل النانونية يستلزم إستغلال تقنية أخرى لزيادة التحكم فى إنطلاق العقار من الحوامل النانونية. وفقًا لذلك ، سيتم إستغلال المجموعات الوظيفية المتعددة للزلال البشري بالإضافة إلى مجموعة الكربوكسيل الخاصة بحمض التيموزولميد للإقتران الكيميائي للشقين للحصول على تحكم أفضل في إنطلاق العقار.
الجزء الثاني: تحضير وتوصيف مقترن حمض التيموزولميد بالزلال البشري
في هذا الجزء ، تمت محاولة الإقتران الكيميائي لـحمض التيموزولميد بالزلال البشري. تم ربط حمض التيموزولميد بنجاح بالمجموعات الأمينية للزلال البشري باستخدام EDC. تم إجراء دراسة أولية لظروف التفاعل من خلال تقييم تأثير وقت تنشيط المجموعة الكربوكسيلية ووجود NHS على كفاءة إقتران حمض التيموزولميد بالزلال البشري. وجد أن وقت التنشيط عند 2 و 15 و 60 دقيقة ليس له تأثير إحصائي بارز على كفاءة الإقتران و إن كان التنشيط عند 60 دقيقة قد أدى الى إنخفاضًا طفيفًا في كفاءة الإقتران. بالإضافة إلى ذلك ، أدى وجود NHS إلى تقليل إقتران حمض التيموزولميد بشكل كبير. وفقًا لذلك ، تم إختيار 15 دقيقة لتنشيط المجموعة الكربوكسيلية في غياب NHS كشروط للتفاعلات التالية.
تم بعد ذلك تطبيق الطرق الإحصائية المتقدمة التي تعمل عن طريق الحاسوب لتقييم تأثير نسبة حمض التيموزولميد و الزلال البشري و نسبة حمض التيموزولميد و EDC على كفاءة الإقتران. وجد ان زيادة نسبة حمض التيموزولميد إلى الزلال البشري لها تأثير إيجابي على كفاءة إقتران حمض التيموزولميد بينما لم يوجد تأثير بارز لنسبة حمض التيموزولميد و EDC على كفاءة الإقتران . وفقًا لذلك ، تم إختيارتفاعل R3 المكون من 8: 1 و 2: 1 كنسب مكافئة لكلًا من نسبة حمض التيموزولميد و الزلال البشري و نسبة حمض التيموزولميد و EDC والذي احتوى على 17.93 مول من حمض التيموزولميد مقترن بكل مول من الزلال البشري للمزيد من التوصيف. تم تأكيد إقتران حمض التيموزولميد بشكل أكبر عن طريق قياس درجة الإستبدال٪ بمجموعات أمين الزلال البشري بإستخدام مقايس النينهيدرين. أكد الفحص الحد من مجموعات أمين الزلال البشري بنمط مشابه لذلك الذي يمثل إقتران حمض التيموزولميد. ومع ذلك ، فإن الإنخفاض في عدد مجموعات الأمين التي تم الحصول عليها بمقايسة النينهيدرين يعكس أن مجموعات الأمين تم إستهلاكها ليس فقط في الإقتران مع حمض التيموزولميد ولكن أيضًا في الإرتباط المتبادل مع مجموعات الكربوكسيل الخاصة بالزلال البشري. أدى هذا التشابك إلى تكوين مقترن حمض التيموزولميد بالزلال البشري النانوني. تم تأكيد الإقتران الكيميائي لـحمض التيموزولميد مع الزلال البشري بشكل إضافي بواسطة الرنين المغناطيسي النووي الهيدروجيني (H-NMR) الذي أظهر قمم حمض التيموزولميد المميزة في الألبومين المقترن.
تم قياس حجم المقترنات النانوية الناتجة عن تفاعل R3 بواسطة تقنية تشتت الضوء الديناميكي ووجد أن حجمها 24.49 ± 4.9 نانومتر مع مؤشر تشتت متعدد يساوي 0.38 ± 0.08. كما أظهر تصوير المجهر الإلكتروني للمقترنات النانوية جسيمات كروية ذات حجم مطابق للحجم الذي تم الحصول عليه بواسطة تقنية تشتت الضوء الديناميكي. و قد أظهرت دراسة نمط الإنطلاق إستدامة إنطلاق حمض التيموزولميد من المقترنات النانوية مع نسبة إنطلاق أقل من 20 ٪ فقط خلال 48 ساعة ، وبالتالي نجاح التغلب على المأزق الذي واجهته الجسيمات النانونية المحضره فى الفصل الأول.و بالتالي سيتم استخدام المقترنات النانوية المختارة لمزيد من التقييم لنشاطها في المختبر وفي الجسم الحي.
الجزء الثالث: التقييم في المختبر وفي الجسم الحي للجسيمات و المقترنات النانونية لحمض التيموزولميد مع الزلال البشري
تم تقييم السلوك في المختبر وفي الجسم الحي من الجسيمات و المقترنات النانونية المختارة. تم تمييز الزلال البشري عن طريق إقرانه بصبغة Alexa 488 NHS أو sulfo Cy 7.5 NHS للتتبع في المختبر وفي الجسم الحي. ثم بعد ذلك تم تصنيع الجسيمات و المقترنات النانونية المميزة بإستخدام الزلال البشري الذى سبق تمييزه. تم تقييم مستوى تعبيرالSPARC في خلايا الورم الأرومي الدبقي GL261 والخلايا الجذعية للورم الأرومي الدبقي BL6 عن طريق قياس شدة التألق عند إحتضانها مع الجسم المضاد لـ SPARC المميزبAlexa 647. أظهرت خلايا ال BL6 تعبيرًا أعلى بكثير لـSPARC مقارنة بخلايا الGL261 مع متوسط شدة تألق يساوي 935 و 169 على التوالي بعد حضانة لمدة ساعة واحدة للخلايا مع الجسم المضاد.
تم تقييم الإمتصاص الخلوي لـلجسيمات و المقترنات النانونية المميزة بAlexa 488 بعد 1 , 4 و 24 ساعة من الحضانة مع خلايا GL261 و BL6. أظهر كلا الحاملين زيادة فى متوسط شدة التألق ونسبة الإمتصاص الخلوي معتمده على وقت الاحتضان و تركيزالحوامل المستخدمه. أظهرت خلايا الBL6 تفوقًا على خلايا الGL261 من حيث نسبة الإمتصاص الخلوي و متوسط شدة التألق مع كلًا من الجسيمات و المقترنات النانونية. بالإضافة إلى ذلك ، أظهرت المقترنات النانونية إمتصاصًا أعلى بكثير من الجسيمات النانونية في كلا الخلايا المختبره.حيث أظهرت خلايا GL261 و BL6 متوسط لشدة التألق يساوى ̴ 250 و 1400 على التوالي بعد 24 ساعة من الحضانة مع 250 ميكروجرام / مل من الجسيمات النانونية بينما ، أنتجت حضانة مماثلة مع المقترنات النانونية متوسط شدة تألق ̴ 3500 و 5000 لـ GL261 و BL6 على التوالي.
ثم تم تقييم السمية الخلوية لكلا الحاملين على خلايا GL261 و BL6 بواسطة مقياس الMTT بعد 72 ساعة من الحضانة عند تركيز يتراوح بين 1 مايكرومولي -1 ملي مولي لحمض التيموزولميد. و قد أثبتت الجسيمات النانونية الفارغة أنها آمنة على الخلايا حبث تبقى > 80% من الخلايا أحياء عند أعلى تركيز مختبر بينما تقلصت نسبة بقاء خلايا الGL261 إلى 20 ٪ و 25 ٪ عند 1 ملي مولي من حمض التيموزولميد الحر و المحمل فى الجسيمات على التوالي. وبالمثل ، قلل كلًا من حمض التيموزولميد الحر و المحمل فى الجسيمات من نسبة بقاء خلايا الBL6 إلى ̴ 15 ٪ و 20 ٪ على التوالي عند تركيز 1 ملي مولي. و مع إختبار السمية الخلوية للمقترنات النانونية ، وجد انها قلصت نسبة بقاء خلايا الGL261 إلى 27 ٪ و 30 ٪ عند تركيز 1 ملي مولي من حمض التيموزولميد الحر و المقترن على التوالي كما قلصت نسبة بقاء خلايا الBL6 إلى 27 ٪ و 47 ٪ من حمض التيموزولميد الحر و المقترن عند نفس التركيز.
تم تتبع التوزيع الحيوي للجسيمات و المقترنات النانونية المميزة بصبغة ال sulfo Cy7.5عن طريق التصوير خارج الجسم الحي للأعضاء المستأصلة بعد 24 ساعة من الحقن الوريدي للحوامل/المقترنات النانوية في الفئران الحاملة للورم الدبقي BL6. مع تتبع الحوامل فى اعضاء الجسم المختلفة,وجد ان كلا الحاملين قد تراكم في جميع الأعضاء الرئيسية بالإضافة إلى المخ. وعن طريق تقطيع المخ ، وجد ان الحوامل النانونية قد تمركزت فى نفس موقع الخلايا السرطانية, الوضع الذى ظهرعن طريق تداخل تلألؤ الورم الحيوي مع الصبغة الفلورية للحوامل النانونية.
أخيرًا ، تم تقييم التأثير العلاجي للجسيمات و المقترنات النانونية المحملة بحمض التيموزولميد مقارنةً بـحمض التيموزولميد الحر في نموذج الفئران الحاملة للورم الدبقي BL6. لم تظهر جميع المجموعات المختبرة أي فرق بارز في وزن الجسم خلال الدراسة بأكملها بما في ذلك المجموعة المرجعية. بالإضافة إلى ذلك ، لم يكن هناك فرق كبير في مؤشر الأعضاء بنهاية التجربة. و قد أظهرت المجموعة المعالجة بحمض التيموزولميد الحر أقل عبء للأورام تليها مجموعة المقترنات النانونية ثم مجموعة الجسيمات النانونية وأخيراً المجموعة المرجعية. على الرغم من أن الاختلاف في عبء الورم لم يكن كبيرًا ، إلا أن الإستجابة المتأخرة للمقترنات النانونية تشير إلى أن التحكم فى إنطلاق حمض التيموزولميد من المقترنات النانونية قد ساعد في الحفاظ على تركيز طويل الأمد لحمض التيموزولميد في الجسم الحي.
لقد أثرت الطبيعة الصعبة لحمض التيموزولميد والتباين العالي في الجرعات المستخدمة وتكرار الجرعات بالإضافة إلى التحديات التي يواجهها نموذج الورم المختار (الخلايا الجذعية) على نتائجنا. وفقًا لذلك ، يجب إجراء المزيد من الدراسات على هذا النموذج من الورم لتحقيق تأثير أكثر بروزًا لحمض التيموزولميد من خلال تعديل بروتوكول العلاج للحصول على أفضل النتائج.