الفهرس 
INTRODUCTIONOnly 14 pages are availabe for public view
 |  | from | 89 |  |  |
| | | from | 89 | | |
Abstract
أجریت ھذه الدراسة في معھد بحوث الھندسة الوراثیة الزراعیة التابع لمركز البحوث الزراعیة بالجیزة وقسم الوراثة بكلیة الزراعة – جامعة عين شمس– خلال الفترة من9201- 2320 على صنف البطاطس دیزیریه.
الهدف الرئيسي من هذه الدراسة هو زيادة كمية نشا الأميلوبكتين في درنات صنف البطاطس ديزرية.
تعتبر البطاطس من محاصيل الدرنات الموسمية ذات القيمة العالية من الناحية الاقتصادية والغذائية ، سواء في مصر أو في جميع أنحاء العالم. وهي تنتمى لنباتات العائلة الباذنجانية.
يعتبر محتوى النشا في درنات البطاطس عاملاً رئيسياً في تحديد استخدام البطاطس. غالبًا ما تستخدم البطاطس عالية النشا في الأطعمة المصنعة مثل البطاطس المقلية ورقائق البطاطس والبطاطس المجففة. غالبًا ما تستخدم البطاطس التي تحتوي على نسبة منخفضة إلى متوسطة من النشا في المرق الطازج أو المرق. بالنسبة للسوق الطازج ، يعد مظهر الدرنات من الاعتبارات المهمة الأخرى ، بما في ذلك نسيج الجلد واللون ولون اللحم وشكل الدرنات. وقد ظهرت أشكال مختلفة من أصناف البطاطس المتخصصة في السنوات الأخيرة ، وأصبحت ألوان الجلد واللحم ذات اللون الأحمر أو البنفسجي أو الأصفر شائعة بسبب سهولة طهيها وقيمتها الغذائية العالية.
وفي التطبيقات الصناعية ، تعتبر كمية ونوع النشا في البطاطس اعتبارات مهمة. فالبطاطس التي تحتوي على نسبة عالية من الأميلوبكتين لها تطبيقات في إنتاج المواد البلاستيكيه المعاد تصنيعها والمواد المضافة للأغذية والمواد اللاصقة والكحول. وكذلك النشويات ذات المحتوى العالي من الأميلوبكتين مناسبة للأطعمة المصنعة والتطبيقات الصناعية الأخرى نظرًا لخصائصها الوظيفية الفريدة. على سبيل المثال ، مثل هذه النشويات هي الشكل المفضل للاستخدام كمثبتات ومكثفات في المنتجات الغذائية وكمستحلبات في صلصات السلطة. يستخدم الأميلوبكتين أيضا بشكل شائع في الأطعمة المجمدة نظرًا لثباته في التجميد والذوبان. بالإضافة إلى ذلك ، أنتجت البطاطس الغنية بالأميلوبكتين مستويات أعلى من الإيثانول مقارنة بالنشويات الأخرى.
تعمل تقنية الكريسيبر-Cas9 على توسيع مجموعة الأدوات المتاحة للمربين وتمثل الطريقة الأكثر مباشرة والأسرع فى دمج الصفات والسمات المرغوبة في أصناف المحاصيل التجارية الشائعة. وتعتبر التربية التقليدية عملية طويلة يمكن أن تستغرق من عشرة إلى خمسة عشر سنة. ونظرًا لتعقيد جينوم البطاطس ، فإن إنتاج أصناف جديدة مكملة بشكل صحيح ذات صفات مرغوبة يمثل تحديًا للتكاثر التقليدي. وقد زادت كفاءة التكاثر الجزيئي من كفاءة التكاثر التقليدى، وقد أضاف تحرير الجينات باستخدام تقنية الكريسبر- Cas9 مستوى آخر من التعقيد.
ومن خلال هذه الدراسة ، قد تم إحداث طفرة جينية لنباتات البطاطس صنف الديزرية عن طريق التحوير الجيني باستخدام سلالة LBA4404 من بكتريا الأجروبكتيريم التي تحتوي على البلازميد pCAS9-TPC الذي يحمل تسلسل التتابعات الدالة ( sgRNA ) ليتم نقله إلى أوراق البطاطس المستخدمة في الدراسة. وبعد مراحل التجديد يتم إستخدم الأوراق في التجربة ووصولها لمرحلة النبات الكامل. وتم إجراء التجارب التأكيدية على المستوى الجزيئي عن طريق تفاعل البلمرة المتسلسل على مستوى الحمض النووي للتأكد من أن النباتات المتحورة تحتوي على الطفرات المطلوبة وكذلك إجراء التحليل الكيميائي الحيوي بإستخدام صبغة اليود على درنات البطاطس.
ويمكن تلخيص الإجراءات التي تمت في المعمل لإنتاج نباتات معدلة وراثياً على النحو التالي:
1- تصميم التتابعات الدالة sgRNA وتخليق ال oligos.
2- إدخال ونقل التتابعات الدالة sgRNA في البلازميد pChimera ، ويتم قطع تتابعات sgRNA وربطها في البلازميد التعبيرى pCAS9-TPC قبل إدخالها في سلالة LBA4404 لبكتريا الأجروبكتيريم.
3- إجراء الخطوات اللازمة للتعديل او النقل الوراثى فى أوراق النباتات عن طريق العدوى ببكتريا الأجروبكتيريم المحتوية على تتابعات sgRNA.
4- وبعد إنتهاء مراحل التحول الوراثى ، يتم زراعة الأوراق على وسط MS بجرعة 5 مجم 2-4 ، د / لتر لمدة 6 أيام في الظلام قبل نقلها إلى وسط يحتوي على 1 مجم / لتر من حامض الإندول أسيتك أسد ، البنزيل أدينين ، و 10 مجم / لتر من حامض الجبريليك لمدة 90 يومًا تحت الإضاءة.
5- وللتعرف على النباتات المحورة جينيآ ، تم استخلاص الحمض النووي لكل فرع وتحليله باستخدام تفاعل البلمرة المتسلسل.
6- وبعد الحصول على نباتات معدلة جينيآ، تم زراعتها في صوبات بلاستيكية لإنتاج درنات يمكن استخدامها في الفحص البيوكيميائي باستخدام صبغة اليود.
وفيما يلي نظرة عامة وتلخيص للنتائج المتحصل عليها:
1- 100٪ من الكالس للصنف ديزرية تم إنتاجها بعد شهر واحد من النقل الجيني بواسطة سلالة LBA 4404 لبكتريا الأجروبكتيريم والتي تحمل التتابعات الدالة من sgRNA على بلازميد pCAS9-TPC.
2- حقق الصنف ديزرية نسبة نجاح 79٪ في التجدد وإنتاج براعم جديدة بعد 10-12 أسبوع.
3- بعد مرور60 يومًا من إجراء التجربة، تم استخلاص الحمض النووي من النباتات. باستخدام جين bar لاكتشاف النباتات المحورة جينيآ ، وتم إجراء تفاعل البلمرة المتسلسل. ولقد أظهرت النتائج أن 23 نباتًا يحتوى على جين bar ، وأظهرت النباتات جميعها حزمآ عند الحجم المتوقع وهو عند 400 زوج نيكلوتيدى.
4- تم الحصول على أربعة نباتات من الديزية هما (DE 19 و DE 28 و DE 34 و DE 35) وقد حدث لها تحويرآ جينوميآ في منطقة التتابعات الدالة sgRNA وفى موقع ال pam باستخدام تسلسل Sanger باستخدام البادئات nd1 و nd2 للنباتات المحورة جينيآ.
5- خضعت درنات سلالات البطاطس الطافرة صنف ديزرية 19 و 28 و 34 و 35 إلى التنميط الظاهري للنشا باستخدام صبغة اليود تحت المجهر الضوئي. وتم التعرف على نشا الأميلوبكتين ، مما أدى إلى ظهور حبيبات النشا ذات اللون الأحمر والبني ، مقارنة بنشا الأميلوز الذي يصبغ باللون الأزرق.
6- أظهرت النتائج أنه من جميع التجارب السابقة تلعب الأنماط الظاهرية للنباتات المرغوبة وخصائص جودة النشا للدرنات دورًا رئيسيًا في البطاطس. ويعد توافر تطبيقات الكريسبر- 9Cas القوية ، واختيار الجينات المستهدفة ، وبروتوكولات التحول الوراثى فى النبات الفعالة والحد الأدنى من الطفرات غير المستهدفة هي القضايا الرئيسية في البطاطس الرباعية. إنها حقيقة أن تحسين الصفات متعددة الجينات أكثر صعوبة من تلك الخاصة بالصفات أحادية الجين ، خاصة في البطاطس ، وبسبب تعدد الأليلات والتكاثر الخضرى.