الفهرس 
IntroductionOnly 14 pages are availabe for public view
 |  | from | 215 |  |  |
| | | from | 215 | | |
Abstract
يهدف هذا البحث الي فحص النشاط البيولوجي للمستقلبات الميكروبية للسودوموناس إيروجينوزا. ولهذا الغرض تم جمع ١٢٥ عزلة من السودوموناس إيروجينوسا من مصادر سريرية مختلفة و٢٥ عزلة بيئية من الأراضي الزراعية المزروعه بمحصول الأرز لتقييمها. وتم اختبار النشاط المضاد للميكروبات لكل من عزلات السودوموناس إيروجينوسا السريرية والبيئية ضد الكائنات المؤشرة ومنهي السلالات القياسية موجبة وسالبة الجرام والكانديدا البيكان C. albicans القياسية و المكورات العنقودية الذهبية (MRSA) المعزولة سريرياً.وتم استخدام طريقة cross-streak و طريقة انتشار الاجار لتقييم المقاومة الميكروبية للسودوموناس إيروجينوزا ضد الكائنات الحية الدقيقة المؤشرة. حيث أظهرت النتائج انه خمسة وعشرون عزلة سريرية و ستة عشر عزلة بيئية من السودموناس إيروجونوسا لها نشاط مضاد للميكروبات ضد جميع الكائنات المؤشرة المختبرة. والجدير بالذكر انه السلالات القياسية S. aureus Newman (NCTC 8178) و C. albicans SC5314 هي الاكثر عرضة لنشاط السودموناس المضاد للميكروبات. أظهرت بعض عزلات السودوموناس السريرية نشاط ضد المكورات العنقودية الذهبية(MRSA) المعزولة سريريا في حين لم تظهر العزلات البيئية اي نشاط ضدها. وأظهرت كل من السودموناس إيروجونوسا السريرية والبيئية نشاطا أقل ضد السلالات القياسية سالبة الجرام.البيوسيانين هو مستقلب ثانوي تفرزه السودوموناس إيروجينوسا ويعتبر صبغة طبيعية نشطة للأكسدة والاختزال مع العديد من التطبيقات المفيدة. كان الهدف الرئيسي من هذه الدراسة هو تقييم عملية إنتاج البيوسيانين في عزلات السودوموناس إيروجينوسا التي تم جمعها من أصول سريرية وبيئية. كشفت النتائج أنه من بين ١٢٥ عزلة سريرية من السودوموناس إيروجينوسا التي تم جمعها ، تمكنت ٥٧ عزلة من إنتاج البيوسيانين بتركيزات مختلفة ، ومن بين ٢٥ عزلة بيئية ، تمكنت إحدى عشرة عزلة من إنتاج البيوسيانين بتركيزات متفاوتة. لمزيد من الدراسة ، تم استخلاص البيوسيانين من أعلى العزلات المنتجة السريرية (PsC05) والبيئية (PsE02) على نطاق واسع.تم استخدام كل من عينات (PsC05) و (PsE02) لإنتاج البيوسيانين علي نطاق أكبر باستخدام طريقة الكلوروفورم، تلاه التنقية باستخدام كروماتوغرافيا عمود السيليكا silica column chromatography ، وتوصيف البيوسيانين المنقى باستخدام الرنين المغناطيسي النووي (NMR) ، ومقياس الطيف الضوئي للأشعة المرئية وفوق البنفسجية UV-Vis Spectrophotometer ، والتحليل الطيفي بالأشعة تحت الحمراء لتحويل فورييه (FTIR) وكروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة (TLC). حيث أظهر صفات البيوسيانين الذي تم تنقيته انها متطابقة مع الصفات القياسية للبيوسيانين القياسي.تم تقييم الأنشطة المضادة للميكروبات والفطريات للبيوسيانين المنقى ضد البكتيريا المعزولة سريريا سالبة الجرام وإيجابية الجرام MDR / XDR ، ومسببات الأمراض المنقولة بالغذاء ، و المكورات العنقودية الذهبية MRSA ، و والكانديدا البيكان C. albicans المعزولة سريريا. أظهرت النتائج أن البيوسيانين أظهر نشاطا جيدا ضد الكائنات الحية الدقيقة المختبرة ، مما يشير إلى فعاليته كعامل محتمل مضاد للميكروبات ومضاد للفطريات.بالإضافة إلى أنشطته المضادة للميكروبات والفطريات ، وجد أن البيوسيانين له تأثير كبير على تثبيط واستئصال الأغشية الحيوية التي تشكلها البكتيريا القوية إيجابية الجرام وسالبة الجرام المكونة للغشاء الحيوي ، وكذلك مسببات الأمراض التي تنقلها الأغذية ، بتركيزات مختلفة من MIC (1/2 ، 1/4 ، 1/8 ، و 1/16 MIC). ومع ذلك ، فإن فعاليتها في تثبيط تكوين الأغشية الحيوية ل C. albicans لم تكن ملحوظة عند مقارنتها بالبكتيريا المختبرة.
كما خضع البيوسيانين المنقى لتقييم نشاطه البيولوجي ، والكشف عن إمكاناته كمضاد للأكسدة من خلال فحوصات مختلفة مثل إمكانات مضادات الأكسدة المختزلة للحديد (FRAP) ، و DPPH ، ومقايسات الكسح الجذري ABTS. بالإضافة إلى ذلك ، تم تقييم السمية الخلوية في المختبر ضد مجموعة من خطوط الخلايا السرطانية ، بما في ذلك سرطان الخلايا الكبدية (HEPG-2) ، وسرطان الظهارة (Hela) ، وسرطان القولون والمستقيم (HCT-116) ، وسرطان الثدي البشري (MCF-7) ، وسرطان البروستاتا (PC-3). والجدير بالذكر أنه لوحظ الحد الأدنى من النشاط السام للبيوسيانين ضد خطوط الخلايا الطبيعية WI-38 و WISH. تشير هذه النتائج إلى أن البيوسيانين يحمل إمكانات واعدة كعامل مضاد للسرطان بسبب نشاطه الإيجابي ضد خطوط الخلايا السرطانية مع إظهار الحد الأدنى من السمية تجاه الخلايا الطبيعية.
الأزورين هو بروتين بكتيري يحتوي علي النحاس وموجود بشكل رئيسي في عدد قليل من البكتيريا سالبة الجرام مثل السودموناس وتتمثل وظيفته الرئيسية في نقل الإلكترونات المفردة بين الإنزيمات المرتبطة بسلسلة السيتوكروم. ووجد انه السمية الخلوية للأزورين محددة تجاه الخلايا السرطانية ولا تؤثر على الخلايا السليمة وعلاوة على ذلك ، لها آثار جانبية أقل.
في هذه الدراسة، كنا نهدف إلى اكتشاف وجود الأزورين بين العزلات السريرية والبيئية ، وتنقية بروتين الأزورين ، ودراسة تأثيره السام للخلايا على خط خلايا سرطان الثدي MCF-7. تم استخدام تفاعل البلمرة المتسلسل PCR لإجراء الكشف الجزيئي عن جينات الأزورين. حيث خضعت جميع العزلات التي تم الحصول عليها من مصادر سريرية وبيئية للفحص لتحديد وجود جين الأزورين. أشارت النتائج إلى أنه من بين العينات المختبرة ، تم تحديد 75 عزلة سريرية و 17 عزلة بيئية على أنها تحتوي جين الأزورين. تم اختيار العزلة السريرية (PsC02) لتنقية الأزورين باستخدام كروماتوغرافيا العمود column chromatography. ثم تم إخضاع الأزورين المنقى للتحليل باستخدام تقنية SDS- PAGE ، حيث لوحظ الأزورين في مكانه المتوقع بوزن جزيئي يبلغ 14 كيلو دالتون. بالإضافة إلى ذلك ، تم تقييم النشاط السام للأزورين المنقى ضد خط خلايا الثدي MCF-7. وكشفت النتائج عن نشاط واعد ، بقيمة IC50 تبلغ 54.9 ± 1.1 ميكروغرام / مل.لإنتاج تركيز عالي من البروتين قمنا باستخدام تقفنية البروتينات المؤتلفة (Recombinant proteins) حيث قمنا با ستخدام DNA الذي تم فصله من العزلة السريرية (PsC02) لعمل تضخيم للتسلسل المستهدف باستخدام تقنية البلمرة المتسلسل PRC حيث ظهر جين الأزورين عند حجمه المستهدف. تم إجراء تفاعل البلمرة المتسلسل PCR باستخدام إنزيم البلمرة عالي الدقة Phusion high fidelity DNA polymerase باستخدام البريمرات المصممة لهذه الدراسة.قمنا بعد ذلك بقطع نواتج التفاعل كل على حد ة باستخدام إنزيمات القطع EcoRI و BamHI واستخدم ناقل التعبير عن البروتين (B-pRSET ) vector expression لاستنساخ الجين وانتاج البروتين حيث تم ايضا قطعه بنفس إنزيمات القطع لخلق نهايات لاصقة متوافقة. لنقوم بعدها بفصل منتجات هذه العملية عن طريق جهاز الترحيل الكهربائي ثم تنقيتها من هلام الأجاروز. تم الربط بين كل جين والناقل التعبيري بواسطة انزيم الربط 4T ligase DNA. تم إدخال البالزميد المؤتلفة الناتجة azu / B-pRSET إلى بكتيريا عصويات القولون المؤهلة كيميائيا E.coli Top 10ثم تم انتخابها على أطباق وسط LB المضاف اليه امبسيللين وتم اختيار المستعمرات الصحيحة ليتم فصل البلازميدات منها ثم قطع هذه البلازميدات باستخدام إنزيمات القطع للتأكد من الجين المعني المضاف. وتم اختيار المستعمرات الصحيحة ليتم فصل البلازميدات منها ثم قطع هذه البلازميدات باستخدام إنزيمات القطع للتأكد من الجين المعني المضاف.
تم عزل البلازميد المؤتلف من عصويات القولون المؤهلة كيميائيا وإخضاعه لتحليل التسلسل. أظهر التسلسل الذي تم الحصول عليه تطابق هوية بنسبة 100٪ مع التسلسل المرجعي المقابل من GenBank ، مما يؤكد صحة عملية الاستنساخ الناجحة.لإنتاج البروتين، تم نقل البلازميدات المؤتلفة (pRSET-B / azu) إلى عترة بكتيريا عصويات القولون المؤهلة كيميائيا E. coli BL-21(DE3). أجريت تجارب انتاج البروتين الأولية لتقييم وجود البروتين المطلوب. تم التحقق من هوية البروتين المعبر عنه من خلال تحليل SDS-PAGE وتحليل لطخة وسترنblot Wester . على الرغم من الجهود المبذولة لتحسين عملية انتاج البروتين ، بما في ذلك التعديلات على وسائط التعبير والظروف التجريبية المختلفة ، فشل انتاج بروتين الأزورين بنجاح باستخدام كل من البروتوكول القياسي والأساليب البديلة.التوصيات أفادت الدراسة أنه 25 عزلة سريرية و16 عزلة بيئية من السودموناس ايروجينوزا أظهرت نشاطا مضادا للميكروبات ضد السلالات المؤشرة المختبرة.ومن الجدير بالذكر أن السودموناس ايروجينوزا أظهرت نشاطًا أقوى ضد الميكروبات تجاه المكورات العنقودية الذهبية نيومان والكانديدا البيضاء، متجاوزة فعاليتها ضد السلالات سالبة الجرام. تم التأكد من نقاء البيوسيانين المستخرج بدقة من خلال سلسلة من التقنيات التحليلية، بما في ذلك TLC، NMR، قياس الطيف الضوئي للأشعة فوق البنفسجية، وFTIR. أظهر البيوسيانين خصائص ملحوظة مضادة للبكتيريا والفطريات ومضادة للأغشية الحيوية ضد الكائنات الحية الدقيقة التي تم اختبارها، مما يدل على إمكاناته المحتملة للتطبيقات الطبية والسريرية يعتبر البيوسيانين واعدًا في منع وإزالة الأغشية الحيوية الموجودة على أسطح الأجهزة الطبية، والتي تمثل مصدرًا مهمًا لعدوى المستشفيات علاوة على ذلك، فإن خصائص البيوسيانين المضادة للأكسدة، إلى جانب آثاره السامة للخلايا على خطوط الخلايا السرطانية وتأثيرها الغير سام على خطوط الخلايا الطبيعية، تضعه كبديل محتمل للعقارات الكيميائية في علاج السرطان.التطبيق الناجح لكروماتوغرافيا العمود سهّل استخلاص الآزورين من عزلة السودموناس ايروجينوزا السريرية (PsC02).أظهر الآزورين المنقى نشاطًا كبيرًا مضادًا للسرطان ضد خط خلايا سرطان الثدي MCF-7. تم استخدام تكنولوجيا الحمض النووي المؤتلف في بناء نظم لمحاولة إنتاج بروتينات للأزورين بالبكتيريا. تم استنساخ جين الآزورين بنجاح في ناقل التعبير pRSET-B. على الرغم من المحاولات المتعددة، أثبت التعبير عن بروتين الآزورين المؤتلف في دراستنا أنه يمثل تحديًا.