الفهرس 
CORPUS CALLOSUMOnly 14 pages are availabe for public view
 |  | from | 327 |  |  |
| | | from | 327 | | |
Abstract
multiple sclerosis (MS) is the most common demyelinating disease that leads to non-traumatic disability. Intranasal administration of adipose derived mesenchymal stem cells (ADMSCs) is a non-invasive method that has recently received interests for treatment of neurodegenerative diseases.
Aim: to evaluate the possible protective role of intranasally applied ADMSCs on acute cuprizone induced demyelination in the structure of corpus callosum in adult female mice.
Materials and Methods: five young, albino rats were used for preparation of ADMSCs. In addition, thirty-five adult female mice were divided into three groups. group I (control group); group II (4 weeks cuprizone): subgroup IIa, in which mice were sacrificed after the four weeks, and subgroup IIb, in which mice were given a single intranasally applied PKH-26 labelled ADMSCs (1X106) at the end of the fourth week then they were sacrificed after 24 hours and group III (6 weeks cuprizone): subgroup IIIa, in which mice were sacrificed after the six weeks, and subgroup IIIb, in which mice were given a single intranasally applied ADMSCs (1X106) at the end of the fourth week and were sacrificed after further two weeks. Mice of groups II and III were given 0.2% cuprizone orally daily. The last week before sacrification wire hang test was performed to evaluate the motor function. Corpus callosum specimens were processed to hematoxylin and eosin, Luxol fast blue, immunohistochemical stains for oligodendrocyte precursor cells (Olig-2) and microglia (Iba-1). Immunofluorescent techniques for detection of homing of ADMSCs, transmission electron microscopic examination, histo-morphometric studies and statistical analysis were also done.
Results: intranasally applied ADMSCs effectively reached the corpus callosum. The score time of wire hang test showed a significant decrease in cuprizone subgroups (IIa, IIIa) compared to control. Light and electron microscopic examination of the corpus callosum in cuprizone subgroups revealed unpacked disorganized fragmented, widely separated demyelinated nerve fibers with wide areas of vacuolation. Administration of ADMSCs in subgroup IIIb prevented myelin loss with a significant increase in its area percentage in luxol fast blue stained sections. ADMSCs significantly decreased the number of microglia and increased the number of oligodendrocyte precursor cells with significant increase in the score time of wire hang test compared to cuprizone subgroups (IIa, IIIa).
Conclusions: Intranasal route was an effective route for delivery of ADMSCs to the corpus callosum and ameliorating structural changes in the corpus callosum in cuprizone model of MS. Intranasally applied ADMSCs prevented demyelination, reduced microglia and increased oligodendrocytes precursor cells.
يعد التصلب المتعدد مرضاً يهاجم فيه الجهاز المناعي غشاء الميالين ويسبب ضررًا دائمًا للألياف العصبية مما قد يؤدى في النهاية إلى الإعاقة الجسدية.
يعد الجسم الثفني أكبر مسار عصبي يربط بين نصفي المخ في الثديات. وهو جزء هيكلي ووظيفي مهم من الدماغ. يتعرض الجسم الثفني للعديد من الأمراض التنكسية والاضطرابات مثل مرض التصلب المتعدد، والذي يسبب تلفا في أغلفة الميالين في الألياف العصبية و ضعفا في التواصل بين نصفي المخ.
يمكن استخلاص الخلايا الجذعية المشتقة من النسيج الدهنى بسهولة وبكميات وفيرة نسبية مقارنة بالمصادر الأخرى للخلايا الجذعية. يعتبر أيضاً إعطاء الخلايا الجذعية عن طريق الأنف طريقا مستجداً سهلاً وغير جائر لإعطاء العقاقير.
بناء على ذلك، فقد تم تصميم الدراسة الحالية لتقييم التأثير الوقائي المحتمل للخلايا الجذعية المشتقة من النسيج الدهنى و المعطاة عن طريق الأنف، على بنية الجسم الثفني في إناث الفئران البالغة المصابة بفقدان الميالين الحاد المستحث باستخدام الكوبريزون.
تم استخدام خمسة جرذان بيضاء صغيرة السن لاستخلاص الخلايا الجذعية من النسيج الدهنى، بالإضافه الى خمسة وثلاثون من إناث الفئران البالغة اللاتي تم تقسيمهن إلى ثلاث مجموعات كالأتى :
المجموعة الأولى (المجموعة الضابطة) التي تلقت نظامًا غذائيًا طبيعيًا، وتم تقسيمها إلى ثلاث مجموعات فرعية:
المجموعة الفرعية ١أ: حيث تمت التضحية بالفئران بعد أربعة أسابيع من بداية التجربة. المجموعة الفرعية ١ب : حيث أعطيت الفئران محلول الفوسفات المتعادل عن طريق الأنف في نهاية الأسبوع الرابع، ثم تم التضحية بها بعد ٢٤ ساعة من إعطاء المحلول. المجموعة الفرعية ١ج : حيث أعطيت الفئران محلول الفوسفات المتعادل عن طريق الأنف في نهاية الأسبوع الرابع، ثم تم التضحية بها بعد أسبوعين إضافيين.
المجموعة الثانية (مجموعة الأربعة أسابيع): والتي تلقت نظامًا غذائيًا يحتوي على 0.2 % من الكوبريزون يوميًا لمدة أربعة أسابيع. تم تقسيمها أيضًا إلى مجموعتين فرعيتين: المجموعة الفرعية ٢أ : تم التضحية بالفئران بعد الأسابيع الأربعة.
المجموعة الفرعية ٢ب : في نهاية الأسبوع الرابع، تم إعطاء كل فأر جرعة واحدة داخل الأنف تحتوي على ١ ×١٠ ٦ من الخلايا الجذعية التى تحمل علامة PKH26، ثم تمت التضحية بها بعد ٢٤ ساعة من إعطاء الخلايا الجذعية.
المجموعة الثالثة (مجموعة الستة أسابيع): تلقت نظامًا غذائيًا يحتوي على 0.2 % من الكوبريزون يوميًا لمدة ستة أسابيع. تم تقسيمها أيضًا إلى مجموعتين فرعيتين:
المجموعة الفرعية ٣أ : في نهاية الأسبوع الرابع، تم إعطاء كل فأر محلول الفوسفات المتعادل عن طريق الأنف.
المجموعة الفرعية ٣ب : في نهاية الأسبوع الرابع، تم إعطاء كل فأر جرعة واحدة تحتوي على ١ ×١٠ ٦ من الخلايا الجذعية داخل الأنف. في كلتا المجموعتين الفرعيتين، تركت الفئران لمدة أسبوعين إضافيين على نظام الكوبريزون الغذائي ثم تمت التضحية بها.
تم إجراء تميز الخلايا الجذعية باستخدام قياس التدفق الخلوي ضد علامات سطح الخلية CD44 وCD34 وCD45.
في الأسبوع الأخير من التجربة و قبل التضحية بالفئران، تم إجراء اختبار التعلق بالأسلاك ثلاث مرات لكل فأر ، و تم توثيق وتحليل متوسط وقت الاختبار.
في نهاية التجربة (٤ و ٦ أسابيع)، تم تخدير جميع الحيوانات ثم التضحية بها و تشريح الأدمغة. وتمت معالجة المخ فى كل العينات و إعداده للفحص المجهري الضوئي والإلكتروني. كما تم صبغ الشرائح بصبغة الهيماتوكسيلين والأيوسين (H&E) وصبغة لوكسول فاست بلو (LFB) لفحص بنية الجسم الثفنى. تم أيضًا إجراء التقنيات الهستوكيميائية المناعية النسيجية للخلايا الدبقية قليلة التغصن (Olig-2) و الخلايا الدبيقية الصغيرة (Iba-1). بالإضافة إلى ذلك، تم إجراء الفحص بواسطة المجهر التألقى لتتبع الخلايا الجذعية، في المجموعة الفرعية ٢ب للتأكد من وصولها إلى الجسم الثفني عن طريق الأنف. كما تم إجراء القياسات المناسبة وعمل التحليل الإحصائى لها للمقارنة بين المجموعات المختلفة.
أظهر متوسط وقت اختبار التعلق بالأسلاك انخفاضًا ذو دلالة إحصائية في المجموعة الفرعية ٢أ (٤ أسابيع كوبريزون) مقارنة بالوقت في المجموعات الفرعية الضابطة. كما تم ملاحظة المزيد من الانخفاض في وقت الاختبار في المجموعة الفرعية ٣أ (٦ أسابيع كوبريزون)، مقارنة بوقت الاختبار فى المجموعات الفرعية الضابطة وكذلك بوقت المجموعة الفرعية ٢أ. بينما أدى إعطاء الخلايا الجذعية فى المجموعة الفرعية ٣ب (مجموعة الكوبريزون/ الخلايا الجذعية) إلى زيادة ذات دلالة إحصائية في وقت اختبار التعلق بالأسلاك مقارنة بالمجموعات الفرعية (٢أ و٣أ).
أظهر الفحص المجهري التألقى للعينات الغير مصبوغة من الجسم الثفني من المجموعة الفرعية (٢ب)، وجود علامات خضراء مضيئة للخلايا الجذعية في الجسم الثفني.
لقد أثبتت الدراسة الحالية أن الفئران التي تناولت الكوبريزون لمدة ٤ أسابيع (في المجموعة الفرعية ٢أ) ولمدة ٦ أسابيع (في المجموعة الفرعية ٣أ)، قد أظهرت تأثرا ملحوظا في بنية الجسم الثفني مع تأثر أكبر في المجموعة الفرعية ٣أ مقارنة بالمجموعة الفرعية ٢أ. إلا أنه بعد إعطاء جرعة واحدة من الخلايا الجذعية المشتقة من النسيج الدهنى عن طريق الأنف في المجموعة الفرعية ٣ب، فقد تم الحفاظ على بنية الجسم الثفني مقارنة بالمجموعات الفرعية (٢أ و٣أ) في جميع المتغيرات التي تم قياسها.
أظهر فحص الشرائح المصبوغة بـالهيماتكسولين والأيوسين للمجموعات الفرعية (٢أ و٣أ) (٤ أسابيع و ٦ أسابيع كوبرزين) , أليافًا عصبية غير منظمة، ومفتتة ومنفصلة عن بعضها البعض. كما لوحظ وجود فجوات فى بعض المحاور العصبية. بالإضافة إلى أن معظم الخلايا الدبقية قليلة التغصن ظهرت متفرقة عن بعضها مع وجود أنوية داكنة. بينما في المجموعة الفرعية (٣ب) (مجموعة الكوبريزون/ الخلايا الجذعية)، فقد ظهرت الألياف العصبية مرتبة بشكل منظم، مع وجود القليل من الفجوات. كما ظهرت معظم الخلايا الدبقية قليلة التغصن، مرتبة في صفوف طولية موازية للألياف العصبية، و محتوية على أنوية حويصلية مستديرة.
ظهر الجسم الثفني فى المقاطع المصبوغة بـصبغة لوكسول فاست بلو من المجموعات الفرعية (٢أ و٣أ)، محتوياً على ألياف عصبية باهتة اللون وغير مرتبة. وقد لوحظ انخفاض ذو دلالة إحصائية في متوسط النسبة المئوية لمنطقة الميالين في المجموعات الفرعية (٢أ و٣أ) مقارنة بالمجموعات الفرعية الضابطة. بينما في المجموعة الفرعية (٣ب) ، فقد ظهر الجسم الثفني محتوياً على ألياف عصبية مرتبة بإحكام وملونة بكثافة مع زيادة ذات دلالة إحصائية في متوسط النسبة المئوية لمنطقة الميالين مقارنة بالمجموعات الفرعية (٢أ و٣أ).
أظهرت الشرائح المصبوغة بالتقنيات الهستوكيميائية المناعية ضد Olig-2 في المجموعات الفرعية (٢أ و٣أ) (٤ أسابيع و ٦ أسابيع كوبرزين) زيادة ذات دلالة إحصائية في متوسط عدد خلايا Olig-2 الإيجابية في الجسم الثفني للمجموعة الفرعية (٢أ) مقارنة بالمجموعات الفرعية الضابطة. بينما كان هناك انخفاض ذو دلالة إحصائية في متوسط عدد الخلايا الإيجابية للـ Olig-2 في المجموعة الفرعية (٣أ) مقارنة بجميع المجموعات الفرعية. كما أظهرت معظم الخلايا في كلتا المجموعتين زيادة إحصائية في متوسط النسبة المئوية للخلايا الدبقية السلفية قليلة التغصن مقارنة بالمجموعات الفرعية الضابطة. بينما في مجموعة الخلايا الجذعية (٣ب) (مجموعة الكوبريزون/ الخلايا الجذعية)، فقد لوحظت زيادة إحصائية في متوسط عدد الخلايا الإيجابية للـ Olig-2 مع زيادة إحصائية في متوسط النسبة المئوية للخلايا الدبقية السلفية قلية التغصن مقارنة بالمجموعات الفرعية (٢أ و٣أ) وحتى مقارنة بالمجموعات الفرعية الضابطة.
اما الشرائح المصبوغة بالتقنيات الهستوكيميائية المناعية ضد Iba-1 في المجموعات الفرعية (٢أ و٣أ)، فقد أظهرت زيادة إحصائية في متوسط النسبة المئوية لمساحة التفاعل الإيجابي لـ Iba-1 ومتوسط عدد الخلايا الدبقية الصغيرة النشطة مقارنة بالمجموعات الفرعية الضابطة. كما ظهرت أجسام الخلايا الدبقية الصغيرة بحجم كبير مع تفرعات سيتوبلازمية سميكة ومتعددة. بينما في المجموعة الفرعية (٣ب) (مجموعة الكوبريزون/ الخلايا الجذعية) ، فقد لوحظ انخفاض ذو دلالة إحصائية في متوسط النسبة المئوية لمساحة تفاعل Iba-1 ومتوسط عدد الخلايا الدبقية الصغيرة النشطة مقارنة بالمجموعتين الفرعيتين (٢أ و٣أ).
أظهر الفحص بالميكروسكوب الإلكترونى للجسم الثفني في المجموعات الفرعية (٢أ و٣أ) (٤ أسابيع و ٦ أسابيع كوبرزين)، وجود محاور عصبية غير مرتبة. كما كانت معظم المحاور محاطة بطبقة رفيعة من الميالين والتي بدت متقطعة ومتهدلة في العديد من المناطق. وكانت بعض المحاور غيرمحاطة بالميالين. وقد لوحظ أيضًا وجود فجوات سيتوبلازمية فى بعض المحاور العصبية ، بالإضافة إلى وجود تمدد فى اللبد العصبى مع وجود فجوات واختفاء تام للمحاور العصبية فى بعض المناطق. كما أن الخلايا الدبقية قليلة التغصن كانت متفرقة عن بعضها البعض و أظهرت أنوية فاتحة، في حين أن البعض الآخر كان لديه أنوية صغيرة الحجم و منكمشة. كما لوحظت الخلايا الدبقية بحجمها الصغير و حدودها غير المنتظمة بالإضافة إلى وجود مشتملات كثيفة في السيتوبلازم. بينما في المجموعة الفرعية (٣ب) (مجموعة الكوبريزون/ الخلايا الجذعية) ، كان الجسم الثفني يحتوى على أحجام مختلفة من المحاور العصبية والتي ظهرت مرتبة بشكل منتظم، وكانت محاطة بغشاء الميالين. كما ظهرت معظم الخلايا الدبقية قليلة التغصن محتوية على أنوية بيضاوية متجانسة اللون و غشاء نووي منتظم. بالإضافة إلى ذلك، فقد لوحظ وجود العديد من الخلايا الدبقية السلفية قليلة التغصن، محتوية على أنوية فاتحة متجانسة اللون، وغشاء نووي منتظم.
من النتائج السابقة، تم استنتاج أن إعطاء الخلايا الجذعية عن طريق الأنف كان طريقا فعالاً لكى يصل بها الى الجسم الثفني. كما أظهرت الخلايا الجذعية المشتقة من النسيج الدهنى فعالية في الحفاظ على بنية الجسم الثفني في نموذج الكوبريزون لمرض التصلب العصبي المتعدد في إناث الفئران البالغة، حيث ساعدت الخلايا الجذعية فى منع فقدان الميالين، وزيادة الخلايا الدبقية قليلة التغصن، وتوقف الالتهاب، وتقليل الخلايا الدبيقية الصغيرة النشطة